1.文章简介
| 文章题目 | ircLiP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions |
| 期刊名 | Nature methods IF:25.38 |
| 发表时间 | 2016 |
| 单位 | Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine |
| 测序平台 | Illumina HiSeq2500 platform |
| 相关产品 | CLIP-seq |
2.研究背景
Illumina HiSeq2500 platform
3.研究方法
文章亮点
改进了CLIP-Seq的实验方法极大的减少了CLIP-Seq的实验步骤，同时提高了产物检测的灵敏性和准确性。
4.研究成果
CLIP-Seq的方法十分复杂，protocols列出了至少40个步骤，这些步骤需要几天甚至更多的时间才能完成，并且很容易出现问题。尽管实验方法要求输入大量的细胞（通常是千万计），但是却往往难以获得足够的材料生成高复杂性cDNA文库进行测序。为了解决这一问题，Zarnegar和他的同事首先建立了一种方法能在CLIP-Seq实验中更加容易跟踪RNA。以前的CLIP-Seq的方法是通过凝胶电泳，adaptor连接和RNA纯化来对RNA5’进行放射性同位素示踪，而他们的方法是红外-CLIP-Seq结合（irCLIP-Seq），使用红外荧光染料标记的寡核苷酸与3’端adaptor结合。结合产物可以非常快速和灵敏的检查多个位点。作者使用此系统来优化CLIP-Seq的工作流程，包括免疫纯化RNA碎片和精简或消除RNA沉淀以及纯化等几个方面的步骤。多方面的优化结果表明，相比其他的CLIP-Seq实验该方法需要的细胞数量明显减少，虽然细胞的需求量最终取决于RBP，但是与其他CLIP-Seq方法相比在相同的交联效率下构建cDNA文库需求的细胞数减少了20,000个。
irCLIP-Seq中最显著的进展是介绍了一种thermostable group II intron reverse transcriptase (TGIRT)用于cDNA合成。相比广泛使用的逆转录病毒的逆转录酶，这种酶的高保真，热稳定性等属性使其能够广泛的用于高度结构化的或者修饰RNA模板。相比于优化鼠白血病病毒衍生的Superscript III酶，使用TGIRT时只需要简单的调整构建文库的protocol就可以增加8倍的cDNA。对于难以获得的模板，该方法可以获得大量的好处。
原文出处：
Zarnegar BJ, Flynn RA, Shen Y, Do BT, Chang HY, and Khavari PA. 2016. irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions. Nature methods , 13: 489–492.
