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ircLiP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions

Edited By:汪巍博士

1.文章简介

文章题目 ircLiP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions
期刊名 Nature methods  IF:25.38
发表时间 2016
单位 Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine
测序平台 Illumina HiSeq2500 platform
相关产品  CLIP-seq

2.研究背景

Illumina HiSeq2500 platform

3.研究方法

文章亮点
改进了CLIP-Seq的实验方法极大的减少了CLIP-Seq的实验步骤,同时提高了产物检测的灵敏性和准确性。

4.研究成果

CLIP-Seq的方法十分复杂,protocols列出了至少40个步骤,这些步骤需要几天甚至更多的时间才能完成,并且很容易出现问题。尽管实验方法要求输入大量的细胞(通常是千万计),但是却往往难以获得足够的材料生成高复杂性cDNA文库进行测序。为了解决这一问题,Zarnegar和他的同事首先建立了一种方法能在CLIP-Seq实验中更加容易跟踪RNA。以前的CLIP-Seq的方法是通过凝胶电泳,adaptor连接和RNA纯化来对RNA5’进行放射性同位素示踪,而他们的方法是红外-CLIP-Seq结合(irCLIP-Seq),使用红外荧光染料标记的寡核苷酸与3’端adaptor结合。结合产物可以非常快速和灵敏的检查多个位点。作者使用此系统来优化CLIP-Seq的工作流程,包括免疫纯化RNA碎片和精简或消除RNA沉淀以及纯化等几个方面的步骤。多方面的优化结果表明,相比其他的CLIP-Seq实验该方法需要的细胞数量明显减少,虽然细胞的需求量最终取决于RBP,但是与其他CLIP-Seq方法相比在相同的交联效率下构建cDNA文库需求的细胞数减少了20,000个。
irCLIP-Seq中最显著的进展是介绍了一种thermostable group II intron reverse transcriptase (TGIRT)用于cDNA合成。相比广泛使用的逆转录病毒的逆转录酶,这种酶的高保真,热稳定性等属性使其能够广泛的用于高度结构化的或者修饰RNA模板。相比于优化鼠白血病病毒衍生的Superscript III酶,使用TGIRT时只需要简单的调整构建文库的protocol就可以增加8倍的cDNA。对于难以获得的模板,该方法可以获得大量的好处。

原文出处:

Zarnegar BJ, Flynn RA, Shen Y, Do BT, Chang HY, and Khavari PA. 2016. irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions.   Nature methods , 13: 489–492.

 

 

 

菊子曰 菊子曰:我最喜欢的微博客户端
Category: CNS-Reading2016年7月4日
标签: CLIP-seq
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武汉生命之美科技有限公司成立于2010年7月,是一家专注于将高通量测序技术(NGS)转化为科学发现和产业应用的生物高科技企业。生命之美使用新一代测序技术和RNA-蛋白质互作的科学技术优势,短短数年时间,就成长为一个拥有强大实验室和科研实力的合作平台。生命之美不但已经与各高校、研究所的实验室一起合作science,也启动了与普通大众一起science的模式,希望以健康产品服务每一名个体。生命之美为爱和梦想而来,它期待着与中国、一带一路各国乃至全球的伙伴们一起做一个前所未有的科学梦:用科学祝福全球!

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