1.文章简介
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文章题目 |
PRC2 Is Required to Maintain Expression of the Maternal Gtl2-Rian-Mirg Locus by Preventing De Novo DNA Methylation in Mouse Embryonic Stem Cells |
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中文题目 |
PRC2在小鼠胚胎干细胞中通过阻止DNA从头甲基化维持母系Gtl2-Rian-Mirg基因座的表达 |
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期刊名 |
Cell Reports IF: 8.358 |
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发表时间 |
2015.09 |
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实验材料 |
mESCs |
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测序平台 |
Illumina HiSeq 2000 sequencing system |
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相关产品 |
clip-seq |
2.研究背景
体细胞在一系列转录因子（Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc）的强制表达条件下可以转化为类似胚胎干细胞状态（iPSCs）。然而，iPCSs是否在分子和功能上完全等同于胚胎干细胞还不太清楚。总体来讲，mESCs和iPSCs中mRNA和miRNA表达样式基本一致，然而一些母源表达的lncRNAs和miRNA来源于Dlk1-Dio3印迹基因在iPSC克隆中是表达沉默的（Gtl2OFF clones）。这些Dlk1-Dio3印迹基因沉默表达的iPSC克隆很难培养成为iPSC-derived mice，说明Dlk1-Dio3印迹基因对于胚胎干细胞建立全面的多能性是必须的。本文发现PRC2复合体能够帮助Dlk1-Dio3印迹基因的表达，并且抑制基因位点的DNA甲基化。
3.研究内容
通过在Ezh2-/- 和野生型 mESCs中进行RNA-seq和size-selected small RNA-seq，作者观测到Ezh2-/- mESCs中位于12qf1染色体区域Dlk1-Dio3印迹基因簇的Gtl2-Rian-Mirg 基因位点中miRNA表达发生显著的表达下调。进一步通过global qRT-PCR分析每个染色体上的总miRNA表达，发现Ezh2-/- mESCs中12号染色体上miRNA表达出现显著性的下调。作者通过Northern blot和qRT-PCR也对部分miRNA进行了表达验证。通过ChIP-seq实验进行了RNA Pol II在该基因位点的结合情况进行分析，发现Pol II在该基因位点结合显著下降。同时，作者研究了intergenic differentially methylated regions （IG-DMRs）距离Gtl2启动子约12kb的甲基化水平，发现在Ezh2-/- mESCs中该区域甲基化水平显著上调。同时，作者证实了IG-DMR/Enhancer1是Gtl2-Rian-Mirg 基因的增强子，提示PRC2通过结合IG-DMR/Enhancer1远程调控Gtl2-Rian-Mirg 基因。作者发现PRC2能够与Dnmt3a/3l相互作用，这种相互作用并不依赖lncRNA介导，Gtl2 lncRNA与Ezh2互作能够抑制Ezh2/PRC2在IG-DMR的结合。PRC2通过抑制Dnmt3s对IG-DMR位点的甲基化，进而促进Gtl2-Rian-Mirg 基因的表达。
4.研究方法
研究思路
通过RNA-seq和小RNA-seq技术，在EZH2敲除鼠中寻找EZH2依赖的特异性miRNA、LncRNA目标，发现了EZH2敲除后，12号染色体上miRNA表达显著下调，特别是Dlk1-Dio3印迹基因簇。
对Dlk1-Dio3印迹基因簇进行甲基化分析，发现该基因簇甲基化水平与EZH2表达负相关。
通过胞内互作蛋白分析，发现EZH2能够与Dnmt3s相互作用，并且限制该甲基转移酶对Dlk1-Dio3印迹基因簇的甲基化修饰。
文章亮点
Gtl2-Rian-Mirg 基因位点对于iPSCs细胞多能性至关重要。PRC2复合体功能和DNA甲基化与基因表达直接相关。本研究第一次揭示了PRC2通过与甲基转移酶Dnmt3相互作用，阻止其对Gtl2-Rian-Mirg 基因附近的基因间差异甲基化区域（IG-DMRs）的重头甲基化能力，从而帮助Gtl2-Rian-Mirg 基因的正常表达。
5.研究成果
1.PRC2帮助母源Gtl2-Rian-Mirg基因座位的miRNA和lncRNAs正常表达
为了深入研究PRC2在mESCs中的基因调控功能，在 EZH2敲除mESCs和野生型细胞系中进行了RNA和小片段RNA高通量测序。测序结果表明位于染色体12qf1区域Gtl2-Rian-Mirg基因座位的Dlk1-Dio3印迹基因簇在EZH2敲除细胞系中显著下调。该基因座中包含lncRNA基因（Gtl2，Rian和Mirg），miRNA以及小核仁RNA（snoRNAs），这些均从母系遗传染色体上表达。进一步对每条染色体上的总的miRNA进行global qRT-PCR揭示出在EZH2敲除mESCs中12号染色体上miRNA表达显著下调。同时，在Eed和Jarid2敲除mESCs中，该基因组miRNA表达也出现显著下调。通过研究Dicer，Drosha和Ago2表达没有发现明显变化。说明PRC2复合体对于该基因座的正常表达是必需的。
在EZH2敲除细胞中，通过过表达恢复EZH2表达水平发现，胞内整体H3K27me3甲基化水平得到显著增强，但是该基因座的RNA表达水平并未得到提高。在Gtl2启动子约12kb区域含有一个基因间差异甲基化区域（IG-DMR），发现母系遗传的IG-DMR甲基化水平在EZH2敲除细胞系中显著增强。这些区域建立甲基化标记后，EZH2的重新表达难以逆转这一修饰。同时，作者发现IG-DMR能够作为Gtl2-Rian-Mirg基因座位增强子。Chip-seq实验发现ESC特异的多潜能转录因子（Nanog, Sox2,
Klf4, 和Esrrb)、cohesion(Smc1/3)、mediators(Med1/12), histone marks（H3K27ac, 和H3K4me1），以及PRC2 复合体均聚集于IG-DMR区域，这些结果说明该片段符合作为增强子的显著特征。同时，位于下游450bp处的也发现另一个增强子拥有相同特性。细胞体系报告实验证实了这两段区域的增强子（Enh1和Enh2）活性。在EZH2敲除ESCs中，这两个增强子H3K27as修饰明显下降。通过染色质构象捕获技术（3C），作者揭示了两个增强子在体内能够与与Gtl2启动子相互作用。通过CRISPR/Cas9技术对Enh1和Enh2区域7kb进行敲除，发现Enh1敲除显著影响Gtl2-Rian-Mirg基因座位的表达。
在EZH2敲除mESCs中，Dnmt3a和Dnmt3I表达显著上调。对于DNA甲基化保持的Dnmt1表达则没有显著变化。同样，在Eed和Jarid2敲除mESCs中，也出现了同样的变化。免疫共沉淀实验证明EZH2，以及Jarid2能够与Dnmt3a和Dnmt3I相互作用。这种相互作用并不依赖于Gtl2 lncRNA。同时，作者验证了当Gtl2启动子部分缺失时，能够干扰Gtl2 lncRNA的形成以及增加EZH2在IG-DMR位置的结合，而IG-DMR区域H3K27甲基化并没有显著上调。
原文出处：
Das PP, Hendrix DA, Apostolou E, Buchner AH, Canver MC, Beyaz, et al. GPRC2 Is Required to Maintain Expression of the Maternal Gtl2-Rian-Mirg Locus by Preventing De Novo DNAMethylation in Mouse Embryonic Stem Cells. Cell Rep, 2015,12(9):1456-70.