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RAP

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技术简介

RNA反义纯化技术(RNA Antisense Purification,RAP)运用于研究RNA与DNA、RNA及蛋白质之间相互作用的技术。根据研究对象不同,RAP技术结合了高通量测序(RAP-Seq)和质谱技术(RAP-MS)分别研究与目标RNA互作的基因和蛋白质(Engreitz, Pandya-Jones et al. 2013)。

 

lncRNAs成为一类新的细胞调节因子,在基因调控,染色质结构以及细胞发育过程中发挥着重要作用,但是大多数lncRNAs的作用机制仍不清楚。

 

为解决这个问题我们需要知道这些RNA分子用于实现其功能的相互作用蛋白质,再加上缺乏可以成功分离发生在体内的RNA-protein直接相互作用的可用方法等挑战,所以RNA反义纯化(RNA Antisense Purification)与质谱(Mass Spectrometry)联用(RAP-MS)方法被开发出来,用于鉴定与靶RNA分子直接且特异性相互作用的蛋白质(Engreitz, Pandya-Jones et al. 2013)。

 

RAP已经能够在体内全面映射RNA-DNA相互作用(Engreitz, Pandya-Jones et al. 2013),受X-inactive-specific transcript(Xist)等经典实例的启发,一个流行的假设是许多lncRNA通过与染色质调节蛋白相互作用并将其募集到特定的DNA靶位点来调节基因表达。研究还表明,lncRNAs可以与不同的染色质调节因子相互作用,可以定位到基因组中的特定位点,甚至可以建立含有共同调控的DNA位点的核子结构域。这些科学结果展现了通过映射RNA-Chromatin的相互作用来鉴定lncRNA复合物的直接靶标的需要(Engreitz, Lander et al. 2015)。

 

而且,RAP-RNA通过体内交联鉴定内源RNA-RNA复合物,用反义寡核苷酸探针捕获RNA,以及高通量RNA测序,该方法可系统了解与我们感兴趣的RNA相互作用的RNA,并且还可以区分直接和间接的RNA-RNA相互作用,通过使用对蛋白质和核酸有不同特异性的交联试剂来实现(Engreitz, Sirokman et al. 2014)。

参考文献:

Chu, C., K. Qu, F. Zhong, S. Artandi and H. Chang (2011). “Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions.” Mol. Cell 44(4): 667-678.

Chu, C., R. C. Spitale and H. Y. Chang (2015). “Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs.” Nature structural & molecular biology 22(1): 29-35.

Quinn, J., I. Ilik, K. Qu, P. Georgiev, C. Chu, A. Akhtar and H. Chang (2014). “Revealing long noncoding RNA architecture and functions using domain-specific chromatin isolation by RNA purification.” Nat. Biotechnol. 32(9): 933-940.

技术原理

RAP技术是通过设计生物素或链霉亲和素探针组,把目标RNA拉下来以后,与其共同作用的DNA、RNA或蛋白质就会附在到磁珠上,最后把基因做高通量测序,这样会得到该调控RNA转录调控的下游靶基因。与此同时,可以通过Western Blot验证或者使用MS技术无偏好鉴定所有与目标RNA互作的蛋白。

技术流程

1.RAP-MS

2.RAP-Seq-DNA

3.RAP-Seq-RNA

4.Probe Design

RAP技术与ChRIP技术最大的区别是它使用的探针是120-nt的长探针,表明长探针拥有降低背景噪音的优势。RAP技术不需要对染色质相互作用中涉及的lncRNA结合域有事先了解认知,在整个目标RNA上平铺寡聚核苷酸,使所有潜在的杂交位点都被充分利用,以确保即使在广泛的蛋白质- RNA相互作用、RNA二级结构或部分RNA降解的情况下也能对目标RNA及其结合的蛋白质和DNA进行捕获。

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武汉生命之美科技有限公司成立于2010年7月,是一家专注于将高通量测序技术(NGS)转化为科学发现和产业应用的生物高科技企业。生命之美使用新一代测序技术和RNA-蛋白质互作的科学技术优势,短短数年时间,就成长为一个拥有强大实验室和科研实力的合作平台。生命之美不但已经与各高校、研究所的实验室一起合作science,也启动了与普通大众一起science的模式,希望以健康产品服务每一名个体。生命之美为爱和梦想而来,它期待着与中国、一带一路各国乃至全球的伙伴们一起做一个前所未有的科学梦:用科学祝福全球!

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    2020年10月26日
  • 生命之美与华农赵凌课题组合作文章发表于Genome Biology
    2020年9月17日
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    2020年9月17日
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