GA平台介绍

Genome Analyzer IIx测序技术原理

1)文库制备

将基因组DNA打成几百个碱基(或更短)的小片段，并在两个末端加上接头(adapter)。

2) 桥式PCR产生DNA簇

a、Solexa 测序专用的测序芯片(flow cell)表面连接有一层单链引物(Primer),单链状态的 DNA片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端固定在芯片上;

b、通过扩增反应使得单链 DNA成为双链 DNA;

c、双链再次变性后成为单链，其一端固定在测序芯片上，另外一端(5’或 3’)随机和附近的另外一个引物互补，被固定住，形成“桥“(bridge);

d、在测序芯片上同时有上千万 DNA 单分子发生以上的反应;

e、c 中形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在测序芯片表面再次进行扩增，形成双链;

f、双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增的模板继续扩增反应;

g、在反复进行 30 多轮扩增，每个单分子得到了 1000 倍扩增，成为单克隆“DNA簇群”;

h、“DNA簇群”在Genome Analyzer IIx测序仪上进行序列分析;

3)测序反应

Illumina Genome AnalyzerIIx是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时加入带有4种荧光标记的dNTP，每个碱基末端被 保护基团封闭，每个循环只允许单个碱基合成，经过扫描，读取该次反应后的荧光信号结果，该保护基团被除去，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精 确序列。

Illumina测序平台的特点

1)可控制的高通量

Genome Analyzer IIx系统一次实验可读取量大于15 亿个碱基/芯片。

2)上样需求低

Genome Analyzer系统需要DNA样品的上样量只在pmol级(ng级)，并且能应用在很多样品有限的实验(比如ChIP-seq、Trscriptome- Sequencing,microRNA-seq)中。

3)简单、快速、自动化

这个优势体现在：最小的实验室也能像大型基因组中心一样进行大规模的实验。制备样品文库可以在几小时内完成，一个星期内就能得到高精确度的数据。由独立软 件控制的自动生成DNA簇的过程可以在5小时之内(30分钟手工操作)完成。这个自动化的流程不需要进行Emulsion PCR，减少了手工操作误差和污染可能性，也不需要机器人操作或洁净室。快速的实验流程使Genome Analyzer的能力增至最大，而自动化步移降低了项目的时间和费用。

4)低错误测序比例

利用新颖的可逆荧光标记终止子， 可以在DNA链延伸的过程中检测单个碱基掺入。 由于四个可逆终止子dNTP在每个测序循环都存在，自然的竞争减少了掺入的错配。