1.文章基本信息
| 文章题目 | A new coronavirus associated with human respiratory disease in China |
| 中文题目 | 在中国发现的一种与人类呼吸系统疾病相关的新型冠状病毒 |
| 期刊名 | Nature |
| 作者 | Fan Wu, Su Zhao, Bin Yu, Yan-Mei Chen, Wen Wang, Zhi-Gang Song, Yi Hu, Zhao-Wu Tao, Jun-Hua Tian, Yuan-Yuan Pei, Ming-Li Yuan, Yu-Ling Zhang, Fa-Hui Dai, Yi Liu, Qi-Min Wang, Jiao-Jiao Zheng, Lin Xu, Edward C. Holmes & Yong-Zhen Zhang |
| 发表时间 | 2020.2.3 |
| 作者单位 | 上海公共卫生临床中心&复旦大学公共卫生学院 |
2.摘要
如非典（SARS）和Zika之类的新发传染病对公众健康产生了严重的威胁。尽管研究工作在紧张进行着,但新的疾病何时何地出现仍然有很大的不确定性。最近在中国湖北省武汉市发生了严重的呼吸道疾病。自从第一个病人在2019年12月12日住院以来，到2020年1月25日至少已确诊1975例。流行病学调查表明,疫情的爆发与武汉的一个海鲜市场有关。本文所研究的一个病人是该市场的工作人员,于2019年12月26日住进武汉中心医院。他经历了严重呼吸道综合征包括发烧、头晕、咳嗽。
通过对支气管肺泡灌洗液样本进行宏基因组RNA测序，本文发现一种属于冠状病毒科的新型RNA病毒。通过对完整的病毒基因组（29,903碱基）进行系统发育分析显示，这种病毒和一群之前在中国从蝙蝠身上发现的类非典冠状病毒(属Betacoronavirus,亚属Sarbecovirus)最为相近(核苷酸相似性：89.1%)。此次新冠病毒的爆发表明来源于动物身上的病毒可以在人类身上导致严重疾病。
3.研究背景
本文研究的病人是一个41岁男子，没有肝炎、肺结核或糖尿病疾病史。2019年12月26日（发病后6天）住院。病人一周内出现发热、胸闷、干咳、疼痛和无力等症状。心血管、腹部和神经系统检查都是正常的。全血细胞计数(CBC)测试发现轻度淋巴细胞减少(少于900个细胞每立方毫米), 但白细胞和血小板计数正常。血液化学测试发现高浓度的c反应蛋白(CRP、41.4 mg /L的血液,参考范围0-6 mg / L)，天冬氨酸转氨酶水平、乳酸脱氢- genase、肌酸激酶则略有升高。动脉血气(ABG)测试发现病人有轻度低氧血症（氧含量67mmHg）。第一天入院（发病后6天）胸部X光片发现双肺异常，伴有空域阴影，例如毛玻璃片混浊，局灶性固结和片状固结。CT扫描显示双侧灶性巩固，大叶合并和斑块状合并，特别是在下肺部。胸部X光片显示入院后第5天（发病后第11天）双侧弥漫性斑块状和模糊阴影。初步的病原学调查排除了流感病毒，肺炎衣原体和肺炎支原体的存在，并通过PCR进行了确认。其他常见的呼吸道病原体，包括腺病毒，也通过qPCR呈阴性。尽管进行了抗生素，抗病毒和糖皮质激素的联合治疗，但患者表现出呼吸衰竭上了呼吸机。治疗三天后患者的病情没有改善，他被送进了重症监护室（ICU）。该患者入院6天后被转移到武汉的另一家医院接受进一步治疗。
武汉市疾病预防控制中心（CDC）的流行病学调查显示，该患者在当地的室内海鲜市场工作。值得注意的是，除了鱼类和贝类鱼类外，在疫情爆发之前，市场上还出售各种活的野生动物，包括刺猬，蛇和鸟类（斑鸠），以及动物尸体和动物肉。没有蝙蝠可以出售。尽管患者可能与市场上的野生动物接触过，但他回忆说没有接触活禽。为了调查与这种疾病相关的可能病原，本文收集了病人支气管肺泡灌洗液（BALF）并进行了深层转录组测序。
4.研究方法
临床标本在上海公共卫生临床中心的生物安全3级实验室中处理。本文从200μlBAL液中提取总RNA，构建了双端（150 bp）宏转录组文库并进行测序。本文使用这些数据鉴定并组装出病毒的基因组序列，并进行了一系列系统发育分析。
5.研究结果
- 5.1 病原病毒基因组组装及鉴定
本文从200μlBAL液中提取总RNA构建文库，并使用IlluminaMiniSeq进行了双端（150 bp）测序，总共产生了56,565,928个reads。这些reads经过重新组装并筛选出可能的病原体。在Megahit 组装的384,096个contig中，最长的contig（30,474个核苷酸）具有很高的丰度，并且与蝙蝠SARS样冠状病毒分离株 bat-SL-CoVZC45（GenBank：MG772933）非常相近(89.1％)。本文分别通过RT-PCR和5’/ 3′ RACE试剂盒（TaKaRa）确定并确认了这种新型病毒的基因组序列及其末端。该新病毒被命名为WHCV（也称为“ 2019-nCoV”），其整个基因组序列为29,903 nt（GenBank：MN908947）。123,613个reads可以重新比对到WHCV的完整基因组上，达到99.99％的基因组覆盖率，平均深度为6.04X（范围：0.01X -78.84X）。通过定量PCR（qPCR）估计BALF样品中的病毒载量为3.95×108拷贝/ mL。
- 5.2 新冠病毒基因特征
为了研究WHCV的病毒基因组组成特征，本文将其比对到Beta冠状病毒属的两个代表性成员：人类起源的冠状病毒（SARS-CoV Tor2，AY274119）和蝙蝠起源的冠状病毒（Bat-SL-CoVZC45，MG772933）。基于序列比对和ORF预测，本文对WHCV的非翻译区（UTR）和开放阅读框（ORF）进行了定位。WHCV病毒基因组与这两种冠状病毒相似。WHCV具有典型的beta冠状病毒的5’和3’末端序列，在5’末端有265 nt，在3’末端有229 nt。预测的WHCV的复制酶ORF1ab基因长度为21,291 nt，包含16个预测的非结构蛋白（补充表4），随后是（至少）13个下游ORF。此外，WHCV在nsp1中与SARS-CoV共享一个高度保守的域（LLRKNGNKG：氨基酸122-130）。WHCV的S，ORF3a，E，M和N基因的预测长度分别为3,822、828、228、669和1,260 nt。除了Sarbecovirus病毒所有成员共有的这些ORF区域外，WHCV与SARS-CoV相似，因为它携带一个位于M和N个ORF基因之间的预测ORF8基因（长度为366 nt）。WHCV ORF的功能是根据已知的冠状病毒预测的。
Fig1. SARS和SARS样冠状病毒(包括Tor2、CoVZC45和WHCV)的基因组结构
- 5.3 系统发育分析
为了确定WHCV与已知冠状病毒之间的进化关系，本文基于整个基因组序列的核苷酸序列，非结构蛋白基因ORF1a和1b以及S，E，M和N编码的主要结构蛋白，估算了系统发育树。在所有系统发育中，WHCV都与Sarbecovirus亚属聚集在一起，包括负责导致2002-2003年全球SARS大流行的SARS-CoV，以及从蝙蝠中取样的许多SARS样冠状病毒。但是，WHCV根据基因的使用改变了Sarbecovirus亚型内的拓扑位置，这暗示了这组病毒的重组历史。
Fig2. WHCV及相关冠状病毒ORF1a、ORF1b、E、M基因核苷酸序列的最大似然系统发育树
- 5.4 受体结合结构域比较
为了更好地了解WHCV感染人类的潜力，WHCV的刺突蛋白的受体结合结构域（RBD）与SARS病毒和蝙蝠SARS样冠状病毒中的受体结合结构域进行了比较。与其他相比，WHCV的RBD序列与SARS病毒的RBD序列（73.8％-74.9％氨基酸相同）和包括RB4874，Rs7327和Rs4231的SARS样冠状病毒（75.9％-76.9％氨基酸相同）更加相似，这些病毒可以利用人ACE2受体进入细胞。此外，WHCV RBD仅比SARS病毒 RBD长一个氨基酸。相比之下，与SARS病毒相比，其他蝙蝠SARS样冠状病毒其氨基酸缺失在473-477和460-472位。先前确定的与人ACE2（PDB 2AJF）复合的SARS病毒RBD的12个晶体结构表明，473-477和460-472区直接与人ACE2相互作用，因此在确定物种特异性中可能很重要。本文通过蛋白质同源性建模预测了WHCV，Rs4874和Rp3 RBD结构域的三维蛋白质结构，并将其与SARS病毒RBD结构域的晶体结构（PDB 2GHV）进行了比较。与序列比对一致，WHCV和Rs4874 RBD结构域的预测蛋白质结构与SARS病毒的蛋白质结构密切相关，并且与Rp3预测的RBD结构域的蛋白质结构不同。此外，WHCV S蛋白的N末端与SARS病毒的N末端更相似，而不是其他人类冠状病毒（HKU1和OC43）（扩展数据图8）。总之，WHCV和SARS病毒RBD结构域之间的氨基酸序列和预测的蛋白质结构高度相似，表明WHCV可以有效地利用人ACE2作为细胞进入受体，从而潜在地促进人与人之间的传播。
图2 WHCV冠状病毒刺突蛋白（S）的受体结合结构域（RBD）分析
- 5.5 重组事件分析
为了进一步推测冠状病毒进化史中的重组事件，本文使用了重组检测程序RDP4对WHCV的全基因组序列和四种代表性的冠状病毒-Bat SARS样CoV Rp3，CoVZC45，CoVZXC21和SARS-CoV Tor2进行了分析。尽管相似性图表明WHCV和SARS 病毒或SARS样病毒之间可能发生重组事件，但没有显著证据表明整个基因组都发生重组。但是，在WHCV和SARS 病毒和蝙蝠类SARS样病毒（WIV1和RsSHC014）的S基因中检测到一些过去重组的证据（p <3.147×10 -3至p <9.198×10 -9），相似图表明将WHCV S基因分为三个区域的核苷酸1,029和1,652处存在重组断裂点。在片段1至1029和1652至序列末端的系统发育中，WHCV与Bat-SL-CoVZC45和Bat-SL-CoVZXC21密切相关，而在1030至1651nt区域（RBD区域），WHCV与SARS冠状病毒和蝙蝠SARS样冠状病毒（WIV1和RsSHC014）聚在一组，能够直接人类传播。这些重组事件在冠状病毒病毒中似乎比较常见，没有证据表明重组促进了WHCV的出现。
Fig3. 冠状病毒中S基因可能发生的重组事件
6. 总结
冠状病毒与人类的许多传染病暴发有关，包括2002/3年的SARS和2012年的MERS。其他四种冠状病毒-人类冠状病毒HKU1，OC43，NL63和229E-也与呼吸系统疾病有关。尽管自2005年以来在中国从包括蝙蝠在内的哺乳动物中广泛发现了SARS样冠状病毒，但人类感染冠状病毒的确切来源仍不清楚。本文从中国武汉市一名患有严重呼吸系统疾病的患者的BALF中发现了一种新型冠状病毒-WHCV（2019-nCoV）。系统发育分析表明，WHCV是β冠状病毒属内的一种新型病毒，因此与SARS病毒表现出一定的基因组和系统相似性，特别是在RBD中。WHCV与SARS的基因组和临床的相似性，以及其在临床样本中的高度表达，为WHCV与武汉市正在发生的呼吸道疾病暴发之间的关联提供了证据。尽管仅从一名患者中分离出病毒不足以得出导致呼吸道症状的结论，但本文的发现已经在其他患者中得到了独立的证实。蝙蝠中鉴定出多个SARS样冠状病毒，表明这些动物充当了这些病毒的天然宿主。尽管在中国的蝙蝠中广泛发现了SARS样病毒，但尚未记录与SARS相同的病毒。值得注意的是，WHCV与蝙蝠冠状病毒最密切相关，甚至在nsp7和E蛋白中与Bat-SL-CoVZC45表现出100％的氨基酸相似性。因此，这些数据表明蝙蝠可能是WHCV的宿主。但是，由于首次报告该病时市场上有多种动物在出售，因此需要更多的工作来确定WHCV的天然宿主和任何中间宿主。
译者后记：因为译者能力有限，本文的翻译和解读还有诸多不到位和错误的地方，欢迎各位读者留言讨论、批评和指正。我们会根据读者的讨论和建议及时更新这篇文章的翻译和解读，尽一点微薄之力支持大家的“抗疫”热情和国家的“抗疫”决策。
译者 | 程超
编辑 | 史云隆
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