新冠检测方法M02 | 引起肺炎爆发的2019新型冠状病毒的分子诊断

文章基本信息

文章题目	Molecular Diagnosis of a Novel Coronavirus (2019-nCoV) Causing an Outbreak of Pneumonia
中文题目	引起肺炎爆发的2019新型冠状病毒的分子诊断
期刊名	Clinical chemistry
作者	Daniel K.W. Chu, Yang Pan,Samuel M.S. Cheng, Kenrie P.Y. Hui, Pavithra Krishnan, Yingzhi Liu, Daisy Y.M.Ng, Carrie K.C. Wan, Peng Yang, Quanyi Wang, Malik Peiris and Leo L.M. Poon
发表时间	2020/1/31
作者单位	香港大学，北京市疾病预防控制中心，北京预防医学研究中心，首都医科大学

摘要

背景

一种新型的人畜共患冠状病毒（2019-nCoV）最近在急性呼吸系统疾病患者中被发现。这种病毒在遗传上与SARS冠状病毒和蝙蝠类SARS冠状病毒相近。爆发最初是在中国一个主要城市武汉被发现,随后在中国其他省份也有发现。其他一些国家也报告了与旅行有关的病例。在医护人员中的爆发表明人与人之间的传播发生。目前急需快速检测这种病毒的分子诊断来及早发现感染患者。

方法

我们建立了两种一步法定量实时RT-PCR方法来检测病毒基因组的两个不同区域(ORF1b和N)。引物和探针的设计是针对新型冠状病毒及其近源病毒（如SARS病毒）反应的。这些检测的评价使用了一组阳性和阴性对照。此外，两名新冠病毒感染患者的呼吸道标本得到了检测。

结果

使用从SARS冠状病毒感染的细胞中提取的RNA作为阳性对照，这些研究表明动态范围至少为七个数量级(2×104-2000 TCID 50 /reaction)。以DNA质粒为阳性标准，发现这些测定的检出限为每个反应的最低线可以检测出10个拷贝以下DNA质粒。所有的阴性对照组都呈现阴性结果。两个2019-nCoV 感染患者的样本在测试中呈阳性。

结论

本文已建立的检测方法可以在人样本中快速检测出新冠病毒，从而可以及早识别病人。

非标准缩写: TCID50组织培养感染剂量中位数; SARS严重急性呼吸综合症；MERS中东呼吸综合症。

背景介绍

冠状病毒可分为4属（α，β，γ，和δ），这些病毒可以在动物和人类中检测到。已知有6种冠状病毒可在人与人之间传播。人类α病毒(229E和 NL63)以及β病毒(OC43和 HKU1)是常见的呼吸道病毒，通常引起轻微上呼吸道疾病。与此相反，其他2种人 β 冠状病毒，SARS和 MERS 冠状病毒，对人类具有高致病性。非典型肺炎和中东呼吸综合征的病例死亡率分别为10% 和35%。非典型肺炎和中东呼吸综合症可在人与人之间传播，可能在卫生保健环境或社区环境中引起大规模疫情。SARS和 MERS冠状病毒都是人畜共患病的起源。中东呼吸综合症冠状病毒在单峰骆驼中广泛传播。中东国家超过90% 的单峰骆驼，对MERS冠状病毒呈阳性反应。由于这种动物的高流行率，自2012年发现以来，在受影响地区已经反复检测到从骆驼到人类的偶发冠状病毒人畜共患传播。在2003年SARS爆发的时候，菜市场中外来的哺乳动物（比如果子狸和浣熊狗），被认为是病毒的动物来源。2004年，由于在这些物种中检测到SARS 冠状病毒，导致了暂时性的禁止出售这些动物，从而防止了动物对人类的额外溢出事件。但进一步的监测研究表明，在非市场环境中，这些动物很少对 SARS冠状病毒呈阳性反应，表明它们只是SARS事件中的中间宿主。随后在野生动物中的病毒监测中发现了大量蝙蝠的冠状病毒。有趣的是，几种与人类SARS冠状病毒基因相似的蝙蝠冠状病毒，都在菊头蝠中检测到。这组类似 SARS的蝙蝠冠状病毒，与SARS 冠状病毒一起，形成了一个独特的sarbecovirus亚属。现在人们普遍认为 SARS冠状病毒是几种蝙蝠SARS样β-冠状病毒之间的重组病毒。这些蝙蝠冠状病毒，可以感染实验培养的人类细胞，表明这些动物病毒及其重组体可能对人类健康构成威胁。

2019年12月，一群非典型肺炎患者被发现, 在流行病学上与武汉的一个批发市场有关。一种新型 β 冠状病毒—2019新型冠状病毒(2019-ncov)已在部分患者身上发现。这种病毒在基因上类似于 Sarbecovirus亚属的蝙蝠病毒。截至2020年1月22日，在武汉和其他省份已发现超过200例病例，其中包括4例死亡病例。此外，在多个国家(日本: 1例，韩国: 1例，美国: 1例，泰国: 2例)也发现有近期去过武汉的确诊病人。一些已经确认的病例与菜市场没有流行病学联系，表明在不同的环境下，有人与人之间传播或多重溢出事件的可能性。在准备这篇文章的时候，一起医院暴发感染事件已被报道。这种疾病在人类中的谱系尚未完全确定。感染的症状是高度非特异性的，包括呼吸道症状，发烧，咳嗽，呼吸困难，以及病毒性肺炎。因此，迫切需要针对这种病毒感染的诊断性测试，以确认疑似病例、筛查病人和进行病毒监测。

在这项研究中，我们报道了RT-PCR方法在人类临床标本中检测这种新型病毒的进展。

材料和方法

引物和探针序列

基于 Genbank 中第一个公开的序列(登记号码: MN908947) ，设计了靶向2019-nCoV病毒的ORF1b和N基因区的两个实时RT-PCR检测方法。下载相关病毒序列进行编辑和比对，包括2019-nCoV病毒，SARS 冠状病毒、类似蝙蝠SARS 的冠状病毒以及其他代表性病毒的序列。这些序列的系统发育分析是用邻接法在MEGA X 中进行的。选择两个在这些sarbecoviruses病毒中高度保守的序列区(ORF1b和N)作为引物和探针设计区域。

Orf1b 基因检测的引物和探针序列是:

5’- TGGGGYTTTACRGGTAACCT -3’ (正向引物; y=C/ T，R=A/ G),

5’-AACRCGCTTAACAAAGCACTC-3’ (反向引物; R=A/G)5’TAGTTGTGATGCWATCATGACTAG-3’ (探针修饰5’-FAM/ZEN，3’-IBFQ format; W=A/T)

N 基因检测的引物和探针序列是:

5‘ -TAATCAGACAAGGAACTGATTA-3‘(正向引物),

5‘ -CGAAGGTGTGACTTCCATG-3‘(反向引物)

5‘ -GCAAATTGTGCAATTTGCGG-3‘ (探针修饰5’-FAM/ZEN，3’-IBFQformat)

Orf1b 和N 基因检测的预期扩增大小分别为132bp 和110bp。所有的引物和探针都是从公司购买(Integrated DNA Technologies)。引物和探针序列被证实与其他2019-nCoV基因序列完全匹配，这些基因序列来自全球共享所有流感数据的组织。

GISAID; https://www.gisaid.org/; Accession numbers:EPI_ISL_402119,EPI_ISL_402120, EPI_ISL_402121, EPI_ISL_402123 and EPI_ISL_402124;Accessed 12Jan 2020)

定量RT – PCR检测条件

反应体系（总体积20μL）

4X master reaction mixture 5μL

Forward primer 0.5mmol/L（总浓度）

Reverse primer 0.5mmol/L（总浓度）

Probe 0.25mmol/L（总浓度）

RNA sample 4μL

总体积 20ul

反应条件

逆转录：50度反应5min,95度酶失活20s；进行PCR扩增40循环（变性95度5s，退火延伸60度 30s），整个反应大约1h15min。

根据操作说明书分别纯化RNA和DNA, 病毒RNA提取试剂盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit, Qiagen)，DNA质粒纯化试剂盒(QIAprep Spin Miniprep Kit, Qiagen)。从140μL样品中提取的RNA，60μL洗脱液中洗脱含polyA的RNA。

样本测试

从SARS冠状病毒感染细胞中提取的病毒RNA用于阳性对照。此外，通过SARS冠状病毒ORF1b和N基因检测的RT-PCR产物克隆到质粒中。用连续稀释的RNA或DNA样品评估检测结果。为了确定这些化验的特异性，我们测试了阴性对照样本。这些阴性对照样本包括: 1)从培养病毒提取的RNA: 人冠状病毒(229E、OC43和MERS)、骆驼冠状病毒(HKU23)、人甲型流感病毒(h1n1、h3n2、h5n1和h7n9亚型)、禽流感(h1、h4、h6和h9亚型) 、乙型流感病毒(山贺株和维多利亚株) ，以及腺病毒。2）RNA来自可追溯的人类呼吸系统有反应的冠状病毒（229E ，hku1，nl63，oc43) 、甲型流感病毒(h1n1和 h3n2亚型)、乙型流感病毒(山苍株和维多利亚株)、腺病毒、肠病毒、,人类类流感病毒(piv1,2,3和4) ，呼吸道合胞体病毒，人类偏肺病毒，鼻病毒和人博卡病毒，以及从没有呼吸道病毒感染的病人痰液中提取的 RNA。3）从没有呼吸道病毒感染的病人痰液（n=9）中提取的 RNA。感染细胞的培养上清液或标准病毒转运培养基中储存的临床样品经短暂离心（15,170 x g，2min）后被分离出来。140μl 的上清液进行RNA提取。

这项研究包括两名2019-nCoV凝视感染的患者(病人1和病人2)。对于1号病人，在发病后的第5天收集了痰液样本。在标准病毒转运培养基中储存的痰样品用等体积的痰消化液进行RNA处理。病人2，在出现症状后第3天收集咽拭子样本，储存在标准病毒运输介质中。140μl水样用于病毒RNA提取。本研究无法获得相关的临床和流行病学资料。从这些样本中提取的 rna 被连续稀释，并用化验方法进行检测。

实验结果

实验结果的特异性

在准备这个检测的时候，只能从公共领域获得一个病毒的序列。基于如此有限的序列信息，我们决定开发两种 RT-PCR检测方法，这两种方法可以对sarbecovirus亚属中的多种冠状病毒产生反应（详见图1a，讨论部分结果）。

图1a：2019-nCoV序列分析——2019-nCoV 和相关sarbecoviruses 的系统发育学。

利用冠状病毒分支的附加序列信息，我们选择了高度保守的ORF1b和N基因区（详见图1b）。这样设计允许使用来自SARS冠状病毒的核酸作为阳性对照。

图1b：2019-nCoV序列分析——2019-nCoV 和SARS-CoV的ORF-1b和 N的序列比对

利用从阳性和阴性对照样本中提取的病毒RNA对检测结果进行评价

在检测中，来自被SARS冠状病毒感染的细胞的病毒RNA或含有目标序列的DNA质粒，结果如预期一样呈阳性。使用从已知滴度的病毒培养物中提取的病毒RNA，两种方法的检测线性范围至少有7个数量级(2 x 10⁴-2000 TCID 50 /reaction,数据未显示)。为了准确地确定这些检测方法的检出极限，我们还对连续稀释的阳性对照质粒DNA进行了qPCR检测。在我们的初步试验中，当这个阳性对照质粒大于等于10个拷贝的时候，两个试验（n=5）持续呈阳性反应。说明这个新建立的检测方法是有效的。ORF1b 和 N基因检测的扩增效率分别为99.6% 和95.4%（详见图2, R² > 0.99 in both cases).

在这些测试中，所有的阴性对照都是阴性的（数据未展示）。此外，我们还将已知数量的SARS 冠状病毒加入到相应的阴性对照样本中(10-fold serially diluted virussample; range: 2 x 10⁴-2000 TCID 50 /reaction; Number of tests per concentration: 1)。从这些标本中提取的RNA 在测试中都呈阳性，没有明显的RT-PCR抑制作用。

图2 ORF1b和N基因检测的动态范围

在患者样本中检测出2019-nCoV 病毒

两名疑似患者的呼吸道标本，均用两种RT-PCR 方法进行了检测。两个病人在测试中都是呈阳性的（详见表格1）。从多种稀释RNA样本的初步结果表明，在检测阳性临床标本时，N基因分析法的灵敏度比 ORF-1b 基因分析法高10倍左右。由于这些样本只能进行定性测试，无法确定确切病毒拷贝数量。

讨论

在这项研究中，对sarbecovirus亚属病毒的两套探针检测方法被开发和评估。我们有意使这样的设计对这个亚属的多种病毒都可以进行反应。这是因为关于人类和动物中2019-nCoV病毒的遗传多样性的公布信息不足。2003年，在果子狸和人体中发现的冠状病毒在基因上高度相似，但是也有不同。例如，在果子狸身上发现的SARS 冠状病毒检测到部分序列缺失。在骆驼和人类身上的MERS冠状病毒也发现了类似的微小的序列变异。为了避免2019-nCoV病毒的遗传多样性，我们设计的引物和探针，是用可以与这个分支的冠状病毒起反应的。

我们用阳性和阴性对照样品评估了实验结果。实验结果显示只对 sarbecoviruses 敏感且特异[2]。我们进一步使用了新冠病毒感染病人的呼吸道标本，来证明这些检测方法的潜在用途。测试的临床样本本质上是不同的（痰液VS咽拭子），取样时间也不同（5d vs. 3d）（详见实验方面中样品测试部分）。因此，利用这些数据来确定人体内病毒复制的动力学是不可行的。后续还需要对新冠病毒感染患者在不同发病时间点采集的临床标本做进一步的系统研究。尽管如此，实验结果证明了这些呼吸道样本对新冠病毒的分子检测的临床价值。此外，在所研究的临床样本中，检测新冠病毒 RNA 时，发现N基因 RT-PCR方法更为灵敏[3] 。这些临床样本可能含有表达病毒亚基因组 mRNA 的感染细胞，导致样本中有更多的 N基因拷贝。

除了新冠病毒和SARS-CoV病毒，在人体中没有检测到其它 sarbecovirus 病毒。非典型肺炎在人类中被消灭，最近一次报告的人类非典型肺炎病例是在2004年。在样本中RT-PCR检测结果呈阳性的个体，应被视为受到2019-ncov 或其相关动物冠状病毒感染。根据它们的检测表现，推荐 N基因RT-PCR作为筛选方法，推荐ORF1b 作为确证方法。使用类似 MERS的诊断算法，Ngene阳性/OFR1b阴性的结果应被认为是不确定的，并建议将病例转给WHO参考实验室进行进一步检测。如果有PCR阳性结果，阳性扩增序列分析可以帮助确认结果，并区分新冠病毒和其他遗传相关冠状病毒（例如SARS冠状病毒）。

新冠病毒的生物安全等级尚未完全确定。临床样本进行分子检测时，建议使用生物安全二级规范处理。由于SARS冠状病毒属于生物安全级别3(BSL3)病原体，因此我们在这些测试中特意使用DNA质粒作为阳性对照。这可以避免SARS冠状病毒的基因组RNA散发，该病毒具有通过反向遗传产生感染性克隆的潜力。此外，这也有助于以更具成本效益和健全的方式，将该正对照分发给不同地理区域的实验室。这些DNA质粒对照可以根据要求索取。[1]

在该手稿的的审核过程中，Corman和他的同事报道了利用合成的序列和SARS 病毒，开发RT-PCR检测新冠病毒的检测方法（本公众号同期发布了这篇文章）。

参考文献

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译者 | 余凤云

编辑 | 好果

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