新冠研究致编辑信L2 | 瑞德西韦和氯喹在体外有效抑制新型冠状病毒

文章基本信息

文章题目	Remdesivir and chloroquine effectively inhibit the recently emerged novel coronavirus (2019-nCoV) in vitro
中文题目	瑞德西韦和氯喹在体外有效抑制新型冠状病毒
期刊名	Cell Research
作者	Manli Wang , Ruiyuan Cao , Leike Zhang , Xinglou Yang , Jia Liu , Mingyue Xu , Zhengli Shi , Zhihong Hu , Wu Zhong and Gengfu Xiao
发表时间	2020.2.4
作者单位	武汉病毒研究所、北京药理毒理研究所

 

亲爱的编辑，

2019年12月，以前未曾被认知的病原体引起的一种新型肺炎出现在武汉，一座拥有1100万人口的中国中部城市。最初的病例被发现与华南海鲜市场相关。2020年1月27日，中国官方报告中国大陆的确诊病例是2835例，包含81死亡病例。此外，在香港、澳门和台湾共确诊19例；在泰国、日本、韩国、美国、越南、新加坡、尼泊尔、法国、澳大利亚和加拿大共发现了30例输出病例。病原体很快被鉴定为一种新型冠状病毒，是SARS冠状病毒的近源病毒。目前还没有针对该新病毒的特殊治疗。因此,急需发现有效的抗病毒药物来对抗这种疾病。一种高效的药物发现方法是检测现有的抗病毒药物在处理相关病毒感染时是否有效。新冠病毒属于轮状病毒，而轮状病毒还包括SARS-CoV和MERS-CoV。虽然有部分药物的疗效仍存在争议，但是有几个药物，例如利巴韦林，干扰素，洛匹那韦-利托那韦，皮质类固醇已被用于治疗SARS或MERS患者。在本研究中，针对临床分离的新冠病毒，我们评估了5种FDA批准的抗病毒药物（利巴韦林，喷昔洛韦，硝唑尼特，萘莫司他，氯喹）以及2种广谱抗病毒药物瑞德西韦（remdesivir） (GS-5734)和法匹拉韦（avipiravir） (T-705)。本研究使用标准实验方法测定评估这些药物对细胞的毒性、新冠病毒的滴度和感染率的影响。首先，候选药物的细胞毒性测定在Vero E6细胞（ATCC-1586）里面通过CCK8分析来确定。然后，在不同浓度试验药物存在的情况下，用新冠病毒2019BetaCoV/Wuhan/WIV04/2019对Vero E6细胞进行多重感染，MOI为0.05。对照组采用二甲基亚砜。感染效果是通过定量实时RT-PCR（qRT-PCR）对细胞内病毒拷贝数进行定量评估，并在感染48小时后用免疫荧光显微镜观察病毒核蛋白（NP）的表达来证实（此时细胞病变作用不明显）。

在7种测试药物中，三种核苷类似物需要较高浓度来减少病毒感染，其中利巴韦林 (EC 50  = 109.50 μM, CC50 > 400 μM, SI)>3.65), 喷昔洛韦(EC50 = 95.96 μM, CC50 > 400 μM, SI > 4.17) 和法匹拉韦 (EC50 = 61.88 μM, CC50 > 400 μM, SI > 6.46)。然而，法匹拉韦曾经100%保护小鼠抵抗埃博拉病毒，虽然其有效浓度高达67 μM ，这提示我们法匹拉韦也可以考虑做进一步体内实验。萘莫司他是MERS-CoV强有力的抑制剂，会抑制膜融合，对新冠病毒感染的的抑制数据是EC 50 = 22.50 μM, CC 50 > 100 μM, SI > 4.44。硝唑尼特是一种商业化的抗原生动物药物，拥有光谱抗病毒潜力，能在低微摩尔浓度抑制新冠病毒(EC 50 = 2.12 μM; CC 50 > 35.53 μM; SI > 16.76)，推荐该药物做进一步体内实验。特别值得关注的是两种药物，瑞德西韦(EC 50 =0.77 μM; CC 50 > 100 μM; SI > 129.87)和氯喹(EC 50 =1.13 μM; CC 50 > 100 μM, SI > 88.50)能在低微摩尔浓度下抑制病毒，而且具有较高的选择指数（SI）（详见图1a和1b）。

图1 药物对2019-nCoV的体外抗病毒活性实验

 

A: Vero E6细胞感染2019-nCoV的MOI为0.05 用不同剂量的特定抗病毒药物处理48小时。用qRT-PCR对细胞上清液中的病毒产量进行定量。用CCK-8法测定这些药物对Vero E6细胞的细胞毒性。

B: 免疫荧光显微镜观察瑞德西韦和氯喹治疗后病毒感染情况。

瑞德西韦Remdesivir最近被认为是一种很有前景的抗病毒药物，可以抵抗光谱的RNA病毒(包括SARS/MERS-CoV)对细胞、小鼠和灵长类动物模型的感染。该药物目前正处于用于治疗埃博拉病毒感染的临床开发阶段。瑞德西韦是一种腺苷类似物，它插入到新生的病毒RNA链，导致翻译的提前终止。我们添加时间实验结果显示瑞德西韦在病毒侵入细胞后起作用（详见图1c和1d），这一结果与其假定的作为核苷酸类似物的抗病毒机制相符。Warren等人在灵长类模型里面展示，静脉注射10mg/kg的瑞德西韦可以导致其血液中持续存在活性形式（10μM），并对埃博拉病毒感染提供100%的保护。我们获得的瑞德西韦EC90=1.76 μM, 提示它的工作浓度与灵长类模型中的相似。我们的初步实验结果（附图S2）表明瑞德西韦也可以高效抑制新冠病毒在对其敏感的人细胞系（人肝癌Huh-7细胞）中的感染。

氯喹Chloroquine 是一种广泛使用的抗疟疾和自身免疫性疾病的药物。最近报道显示，最近被报道是有潜力的广谱抗病毒药物8,9。氯喹被报道通过提高内体（endosome）的pH抑制来阻断病毒/细胞融合，同时干扰SARS冠状病毒细胞受体的糖基化。我们的添加时间实验结果显示氯喹在新冠病毒感染Vero E6的侵入和侵入后阶段都起作用（详见图1c和1d）。氯喹除了具有抗病毒活性外，还具有免疫调节活性，可能协同增强其体内抗病毒作用。通过口服后，氯喹在全身广泛分布，包括肺。氯喹抵抗新冠病毒感染Vero E6细胞的EC90=6.90 μM, 在临床上类风湿患者接收500mg注射他们的血浆药物浓度就实现了这个浓度。氯喹是一种廉价且安全的药物，已经使用了70多年，因此，它有可能在临床上适用于抵抗新冠病毒。

图1 药物对2019-nCoV的体外抗病毒活性实验

 

2019-nCoV感染细胞，MOI为0.05，侵入和侵入后实验。

C: 用qRT-PCR定量感染细胞上清液中的病毒

D: Western blot检测感染细胞在14h时，病毒核蛋白（nucleocapsid protein NP）的表达情况。

我们的研究结果表明，瑞德西韦和氯喹在体外对新冠病毒感染有很好的控制作用。由于这些化合物已经在有安全记录的人类患者中被使用，并且证明对不同疾病有效，我们建议这些药物可以在患有新型冠状病毒病的人类患者进行评估。

 

译者后记：因为译者能力有限，本文的翻译和解读还有诸多不到位和错误的地方，欢迎各位读者留言讨论、批评和指正。我们会根据读者的讨论和建议及时更新这篇文章的翻译和解读，尽一点微薄之力支持大家的“抗疫”热情和国家的“抗疫”决策。

 

译者 | 余凤云

编辑 | 平安

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