Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges

1.文章简介

2.研究背景

为了调节成熟RNA的活性，通常的观念认为需要过量表达miRNA靶标位点。所谓的miRNA海绵的研究概念是指最初执行并且导致通过增加内源性靶标水平导致miRNA功能缺失。内源性表达的线性的RNA已显示出螯合并抑制植物中（目标拟态）和哺乳动物miRNA活性（竞争内源RNA）。总的来说，这些数据表明miRNA的海绵是在许多真核生物miRNA活性的普遍调节。然而，所述miRNA海绵或识别迄今在低的水平表达的miRNA竞争的转录，包含miRNA靶位点的数量有限，并且，类似于miRNA靶标，它们本身受miRNA介导的不稳定

3．文章亮点

该论文提出了一种全新的CLIP方法，称为enhanced CLIP (eCLIP)。该方法为RBPs在全基因组范围内的maps提供了一个更加强大，标准化的框架。显著的降低了测序过程中所需要扩增的次数，并且极大地提高了RBPs文库可读百分比的成功率。此外，eCLIP还改善了配对input controls的发现auehentic位点的信噪比。

4.研究结果

我们最近发现在人类和小鼠brain8高表达内源性环状RNA（circRNA），并证明了circRNA可以endonucleolytically受miR-671在AGO2依赖性切割;然而，这circRNA的功能不明。通过搜索在此circRNA miRNA靶位点，我们确定了miR-7上有73个常规种子目标。绘制目标部位的位置和核苷酸养护，我们观察到靶位点进行比较，以在所有真哺乳亚纲哺乳动物相邻区域而不是在袋动物选择性地保守。虽然在尺寸可变的，这circRNA，CIRS-7，存在于所有哺乳动物真兽亚纲的研究基因组。

人类CIRS-7使用MEME的计算主题分析显示的miR-7与另外3’端碱基配对的种子目标的高患病率;然而，它们在双链防止miRNA介导的endocleavage的中央部分不匹配。所述miR-671靶位点呈现近乎完美的互补性和跨物种非常小的变化，以及高的双链体的稳定性相比的miR-7。可在线AGO2免疫沉淀接着通过高通量测序（HITS-CLIP）从小鼠脑数据的分析显示上的CIR-7的小鼠变体的高度AGO2占用的，与序列读数分散在整个的CIR-7，和最高的读取密度覆盖区域最高8核苷酸靶位丰。重要的是，HITS-CLIP读取近端非线性剪接位点支持AGO2和CIRS-7之间的关联。这证实了我们先前观察表示在人类和小鼠的脑和其他研究分析的脑特异性表达的CIR-7的高表达的miR-7。
为了研究CIRS-7表达对的miR-7活性的影响，我们建立了一个基于矢量的系统表达circRNA。该biogenesisof circRNAs是目前不明;然而，先前的研究已经表明，由反向重复侧翼外显子诱导由非线性剪接体外circRNA形成，这被认为是生产圆形Sry基因RNA的必要。因此，我们插入CIRS-7外显子与内源性侧翼序列到pcDNA3。接着，我们复制上游侧翼序列的一部分，并在一个相反的方向插入其下游。pcDNA3-CIRS-7-的瞬时表达，但不缺乏下游反相序列（的pcDNA3-CIRS-7–IR）的构建物，导致产生一个circRNA物种，这是无法区分的内源性通过RNA分析和PCR表达circRNA的逆转录。此外，我们构建了含有所有的miR-7海绵部位，但不包括剪接位点和侧翼序列的线性和聚腺苷酸化的miR-7海绵。由烟草酸线性RNA的酶促消化焦磷酸后跟终止核酸外切酶或RNA酶ř裂解证实从CIRS-7产生的RNA的圆形结构。通过共表达circRNA-或用miR-7或miR-769的表达载体线性RNAproducing矢量，CIRS-7水平不受影响，而线性构建体显示的miR-7的灵敏度和由超过40±12％跨越降低生物学重复，大概是由于脱腺苷的miRNA介导的活化和随后的核酸外切降解。这

表明，在CIRS-7的目标网站不受miR-7支持endocleavage，并且CIRS-7是mRNA的常规的miRNA不稳定抗性，因此不容易与miR-7依赖性调节。
以确定的CIR-7是否用作AGO2和miR-7的结合平台，我们在HEK293细胞中瞬时进行的Myc-AGO2免疫共表达的miR-7或miR-769作为对照。通过定量RT-PCR（QRT-PCR），通过AGO2内源性CIRS-7-下拉中相比的miR-769转染的细胞的miR-7转染的细胞被特异性富集超过50倍，强烈暗示了miR-7为促进与CIRS-7 AGO关联。此外，使用生物素 – 偶联的miR-7模拟，我们观察到比CIRS-7中的miR-7拍摄分数相比于阴性对照的六倍富集，生物素化的一个多个miR-138。加强的miR-7，AGO2和CIRS-7之间的三元复合物的观察到的形成，我们设计含有结合所有推定的miR-7靶位点有或没有链霉适体基序的T7转录物。正如所料，通过温育从HEK293细胞用溶胞产物的线性T7转录表达任一的miR-7或控制的miR-769，AGO2and的miR-7有效地提取仅含有frommiR-7-细胞裂解物。这表明内CIRS-7-所述miR-7位点都能够促进细胞裂解物的特定的miR-7-AGO2相互作用。两者合计，我们的结论是普遍AGO占用量受miR-7-引起AGO2蛋白直接关联于CIRS-7 RNA干扰盛行，保守的miR-7的目标网站。

评价miR-7和CIRS-7的亚细胞定位，我们在原位杂交（FISH）在HEK293和HeLa细胞进行RNA的荧光细胞共转染CIRS-7和miR-7。这表明CIRS-7和miR7之间的大程度的重叠不同的细胞组织内，这表明共定位。免疫共染色与P bodyspecific标记DCP1A揭示的CIR-7共定位用P机构;然而，当circRNA被用miR-7共表达这仅观察到，这表明的miR-7间隔化的CIR-7的机构。内源性CIRS-7和miR-7信号也重叠在从鼠脑分离的原代细胞，如通过双荧光团的RNA-FISH分析测定。

5.参考文献

1. Hansen TB, Jensen TI, Clausen BH et al. 2014. Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges. Nature, doi: 10.1038/nature11993.