Single-cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells

1.文章简介

2.研究背景

一种罕见的多能造血干细胞群体（HSCs）需要连续生产百万成熟血细胞，同时保持不同谱系之间的正确平衡。在造血层次结构的顶点所在的最原始的长期重建造血干细胞（LT-HSCs）。LT-HSCs可以进行三种类型的细胞分裂：（1）重建对称细胞分裂产生补充LT-HSC库中的两个LT-HSC的子代细胞; （2）对称分裂来补充生产短期重建造血干细胞（STHSCs）和多能祖细胞（MPP的）;及（3）不对称分裂，其中一个子细胞仍然是干细胞，其他的功能发生改变。
在骨髓（BM）中造血干细胞的能力会随着年龄增加而显著下降。相应的在老年人中骨髓性疾病例如：白血病，获得性免疫系统功能降低和贫血病的发病率显著增加。目前干细胞衰老主要有两个模型：1，特定表型的多个HSCs克隆共存，但是他们的相对频率会随年龄的变化而改变；2，所有的造血干细胞经历与年龄感官潜在的协同变化。尽管对HSCs功能的随着年龄增加而下降进行了广泛的研究，但是潜在的HSCs衰老的分子机制仍然不清楚。

3.研究方法

研究思路
通过对年轻和年老的小鼠的解剖获得不同的HSCs细胞和可变的造血祖细胞，利用单细胞RNA-seq对不同的细胞系之间内源性细胞状态改变和干细胞群体变型的分子机制进行分析。
文章亮点
在本研究中作者对大约1200个不同的造血干细胞进行了单细胞RNA-seq分析。我们发现，细胞周期支配每个种群内的变异性，并且有细胞的间旧G1期及年幼长期造血干细胞相比，一个较低的频率，这表明它们通过G1遍历更快。此外，老化过程中造血干细胞的转录变化是负相关的那些在HSC分化，使得旧的短期（ST）的造血干细胞相似年轻长期（LT-造血干细胞），这表明它们在分化程度较低的状态存在。我们的结果表明这两种成分变化和与年龄内在的，人口范围内的更改，并且与在细胞周期进程和自我更新与造血干细胞的分化之间的关系是由老化的影响，并可能有助于老的造血干细胞的功能衰退的模型一致。

4.研究成果

1.大约1200个造血干细胞的单细胞RNA-seq分析
为了系统地表征的小鼠造血的第一步骤的过程中各个单元的全局转录景观，我们通过SMART-seq技术对造血干细胞进行了单细胞RNA-seq分析，随后我们使用多参数荧光激活细胞分选（FACS）。我们前瞻性单独地使用LSK（lineage-，SCA1+，KIT+）和SLAM（信号淋巴细胞活化分子）标记，其表达整个小鼠品系和老龄化过程中保守的三种细胞：长期造血干细胞（LSK CD150+ CD48-），ST-造血干细胞（LSK CD150-CD48-）和的MPP（LSK CD150-CD48+）的年轻（2-3个月）和旧的（>22个月）C57BL / 6小鼠。与以前的工作相一致，我们观察到LT-造血干细胞和干细胞库随着年龄的总BM有一个显著扩展（约六倍，P <0.001）。相反，大的小鼠的LSK隔间内的ST-HSC频率可比和MPP频率降低，可能表明自我更新和分化之间的不平衡。 在每两个年龄段（2-3和>22月三种细胞（LT-造血干细胞，ST-造血干细胞，和MPP时）：我们产生1152单细胞的RNA序列分布，相应的群体控制一起，从六个群体每个细胞类型和年龄将近200个细胞）。我们严格的筛选条件保留1059后续的分析高质量的库（约176每个细胞类型和年龄平均;对于质量控制的细节和筛选标准，见方法）。在硅片聚集，从给定的细胞类型的各个细胞的平均单细胞基因表达谱再现其匹配控制人口的基因表达谱（R〜0.9平均。此外，人口或凝集的单细胞的轮廓老少小鼠之间高度相关，这表明老化相关的差异可能是微妙。最后，用于排序这些细胞类型或已知标记物的RNA表达水平关联与他们再现已知的关联。

2. 细胞周期是造血干细胞的转录差异主要来源致肠道发炎菌群的生长，以防止结肠炎
为了揭开变化的主要来源，我们分别针对不同的细胞类型和年龄进行主成分分析（PCA）。引人注目的是，在任何情况下，顶主成分（PC）的主要被与细胞周期相关的基因相关联，表明这里转录异质由细胞周期状态支配。此外，已知的小鼠造血转录模块的分析显示，在整个单个细胞强大的协同调控只对细胞周期的基因模块。当我们分析只有那些细胞未经细胞周期基因明显表达（所有细胞的65％），剩余的最高协同调控是一个核糖体模块，具有一个平均相关低于0.1在每个六个种群。因此，我们得出结论，细胞周期反映的异质性每个HSC细胞类型和年龄的转录组内的主要来源。
进一步解剖细胞周期状态，我们打进使用签名为G1/ S，S，G2和G2 / M限定相对于它的可能的细胞周期阶段每个小区的基础上功能注释的基因本体论联合体（的参考基因组从同步HeLa细胞，并进一步通过共表达在我们的剖面。直接确认这些签名对应于不同细胞周期阶段中，我们通过并发派洛宁Y和Hoechst染色分离KIT富集细胞的细胞周期阶段。从代表细胞周期连续11门测序的RNA表明精确划分基于我们的签名为预期的。最后，我们证实这些签名稳健检测，从人类和小鼠等单细胞数据集的细胞周期阶段。
由这些签名的表达聚类所有造血揭示细胞三个不同的组：第一组，其表达主要G2 / M相的基因（例如，有丝分裂基因）；簇2，具有的G1 / S期的基因（例如，DNA复制的基因）高表达；和簇3，其不显示的细胞周期基因表达（noncycling或静止细胞）。在G1/ S和G2细胞的频率/ M群集（循环细胞）在MPP时比LT-和ST-造血干细胞相当高，与公知的高级别MPP的增殖一致。

3. 造血干细胞衰老和分化
测试对于HSC的老化和自我更新/分化之间的可能联系，我们首先排除了367循环细胞（以避免细胞周期的占主导地位的影响），并在剩下的692 noncycling细胞进行联合的PCA（包含所有类型的细胞和年龄）。每个第一两台PC的造血干细胞分离按细胞类型和年龄。因此，对于这两个电脑，年轻LT-HSC是从旧LT-造血干细胞明显不同（由于年龄效应），以及从年轻ST-造血干细胞（由于分化作用）。有趣的是，年轻LT-HSC是类似于旧ST-造血干细胞，在两个年龄和分化状态的不同。始终如一，无论PC1和PC2与差异化和老龄化呈负相关，得分高的都来自年轻动物的细胞和更多的分化细胞（例如，边际产量和ST-造血干细胞无论从年轻或年老小鼠得分较高比它们的年龄匹配的LT-HSC对应）和两个旧的细胞和分化的较少的细胞得分低。这些结果与从复制实验的表达谱也再现（约200 LT-造血干细胞和大约200 ST-造血干细胞;不同小鼠获得，分类，和相距异形个月）。因此，老LT-造血干细胞和ST-造血干细胞的转录程序类似于比他们年轻的同行，这可能体现自我更新和分化之间的平衡损失少分化状态。这可能与最近的发育开关，其中，在胚胎发育的LT-HSC是对于大多数在未扰动的造血血细胞生产的主要贡献者的发现，而在成年生活中，ST-造血假定角色。为了调查个人LT-造血干细胞和ST-造血干细胞从老少小鼠，无论它们在体内的再造活动的克隆潜力，我们评估了甲基纤维素集落形成。虽然年轻的LT-造血干细胞和ST-造血干细胞产生了类似的菌落数，两个老对手形成显著更多的菌落（1.4和1.3增加了LT-造血干细胞[P <0.001]和ST-造血干细胞[P = 0.01]，分别，独立样本t-检验）。
值得注意的是，PC1和PC2也关联与巨核祖细胞的表达签名（MKP），这样，老细胞表达，平均而言，更高水平的MKP签名基因比他们年轻的同行，和分化程度低细胞有超过分化的细胞较高的MKP表达水平（P <10-6采用Mann-Whitney U检验所有成对比较）。这是与旧的造血干细胞的报道髓偏压大体一致，但MKP签名的基因，并且更一般地，髓相关基因似乎只占一个被HSC中改变一个较大的表达程序的少数分化和衰老。例如，被在四个骨髓祖细胞类型（MKP，预CFU，preMegE，preGM）中的至少一种富集的792个基因仅包括负相关的前100个基因中的24与PC1 PC2 +，因此随着年龄的增长，只有与PC1 PC2 +正相关的前100个基因的16。
为了鉴定候选基因可能依据本反比关系，我们比较了通过分化不同成对的人口之间的各基因的表达（LT-造血干细胞与ST-造血干细胞），或通过年龄（年轻与旧），但相匹配的其他参数。总体而言，我们进行了三次比较分化的影响（在年轻小鼠LT-造血干细胞与ST-造血干细胞，并在老年小鼠重复两次）和老龄化对4个比较（与年轻人老LT-造血干细胞和ST-造血干细胞，每两个重复），以首先确定显著差异（P <0.05，双样本t检验;每对条件之间没有校正的多个测试）。然后，我们确定了78个基因具有一致的老化和分化作用（FDR <0.05;方法）。这些中，除了一个基因（Ctnnal1）显示与衰老和分化的相反的趋势，这表明这些变量之间的反比关系。基因的这个列表包括造血和/或自我更新的几个重要的调节剂，如FLT3，CD34，VWF，IL16，NFIA，ID2，ITGB3，Runx1t1，和CD44。对于某些这些基因的表达的变化是具有自我更新和分化或在旧的LT-HSC的分化缺陷之间的电位不平衡一致，作为Flt3的和CD34（在旧LT-造血干细胞最低）先前已挂HSC分化。我们在蛋白质水平即CD34和FLT3减少与衰老和分化增加进一步验证。

4. 不同年龄的小鼠品系变化的之间是保守的。
寿命与衰老小鼠品系之间变化。例如，C57BL / 6小鼠是长寿命的短命DBA / 2小鼠进行比较。为了测试我们的观察的普遍性，我们还研究了LT-造血干细胞，ST-造血干细胞，并从DBA / 2株，从一个独特的繁殖血统起源老少小鼠的MPP。
通过使用SLAM标记与保守的表达小鼠品系中和年龄，我们量化LT-造血干细胞，ST-造血干细胞的频率，并在MPP的BM通过流式细胞仪和干老少DBA /2鼠标电池仓（LSK）。我们比对C57BL/ 6（约六倍，P <0.001）观察到的LT-造血干细胞频率的年龄相关的增加，尽管到一个较低的程度（约两倍，P <0.001）。此外，血红蛋白浓度和红细胞（RBC）数分别在老年小鼠（血红蛋白10.3显著下与12.7克/升，P = 0.001，和RBC8.2与9.2×106个/μL，p =0.04;独立样本t -test），表明贫血，比C56BL/ 6小鼠（血红蛋白11.8对比为14g / dL，p =0.001，和RBC8.38与9.9×106个/μL，p <0.001）。
接下来，我们用两种方法来比较来自DBA / 2小鼠老少LT-造血干细胞的细胞周期分布。首先，我们从年轻人和老年人DBA / 2小鼠进行单细胞的RNA序列具有前瞻性孤立LTHSCs，ST-造血干细胞和MPP。我们的高分辨率细胞周期分析再次显示在整个细胞周期的轨迹和适度（约两倍）旧LT-HSC的细胞周期轨迹的区域耗尽其大概反映早G1期。第二，染色的BM与Ki67/ Hoechst的显示，是在G1期老LT-HSC的频率降低。流式细胞仪分析显示为ST-造血干细胞类似，虽然不显着，发展趋势。两者合计，旧LT-HSC的在G1期的特定耗尽出现的C57BL / 6和DBA /2品系之间是保守的。
最后，我们研究了上述表达程序的保护。所有noncycling DBA的PCA / 2细胞概括的结果C57BL / 6和显示，前两个PC都随着年龄的增长呈负相关和正相关分化（即ST-造血干细胞与LT-相关造血干细胞）。如在C57BL / 6，年轻LT-HSC是更类似于旧STHSCs比旧LT-造血干细胞中的DBA / 2。此外，虽然与PC1和PC2相关联的基因的部分不同的两种菌株之间，通过使用区分年龄和分化状态中的C57BL / 6作为签名顶端基因，我们概括在DBA相同的效果/ 2 。如在C57BL / 6，PCA每种细胞类型内noncycling小区中表明的年龄为LT-造血干细胞和ST-造血干细胞的显着效果，但不适合的MPP。的MPP显示了类似的模式中的C57BL / 6，其中两个细胞状态酮lymphoidbiased和其他髓偏压的表型定义的MPP内-coexist。综上所述，我们所有的在C57BL / 6主要结果在很大程度上概括的DBA / 2，进一步加强其普遍性。

原文出处：

Kowalczyk MS， Tirosh I et al. 2015. Single cell RNA-seq reveals changes in cell cycle and differentiation programs upon aging of hematopoietic stem cells. Genome Research, 25:1860-1872.