1.文章简介
| 文章题目 | DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells |
| 中文题目 | 在哺乳动物胚胎干细胞中发现腺嘌呤N6 的DNA甲基化。 |
| 期刊名 | Nature IF: 41.456 |
| 发表时间 | 2016.04 |
| 单位 | Department of Genetics and Yale Stem Cell Center, Yale School of Medicine, USA. |
| 实验材料 | mouse embryonic stem cells. |
| 测序平台 | PacBio RS II sequencer |
| 相关产品 | DNA甲基化 |
2.研究背景
DNA 甲基化是一种重要的表观遗传调控机制，在众多物种中被广泛研究。
以前的研究认为在哺乳动物中只存在5mC 甲基化，N6-mA甲基化只在原核生物和少数低等真核生物存在。
哺乳动物是否存在N6-mA甲基化，一直缺乏直接而有力的证据。
3.研究方法
利用小鼠胚胎干细胞作为研究材料，利用SMRT-ChIP高通量测序和多种分子细胞学技术，开展N6-mA甲基化的研究。
研究思路
开发SMRT-ChIP (chromatin immunoprecipitation-enriched DNA)技术用来探究DNA修饰。
探究N6-mA甲基化的生物学功能。
探究N6-mA甲基化的表观遗传调控机制。
文章亮点
第一次在小鼠胚胎干细胞中发现大量的N6-mA甲基化。
探究出N6-mA甲基化的表观遗传调控机制。
4.研究成果
1.在小鼠胚胎干细胞中鉴定N6-mA甲基化
通过开发的SMRT-ChIP 技术， 在小鼠的胚胎干细胞中鉴定出大量的N6-mA甲基化位点，随后采用质谱技术进行了验证。在小鼠的其它细胞系和组织中，用SMRT-ChIP 技术很难检测出N6-mA甲基化, 这就暗示N6-mA 对哺乳动物的胚胎发育有重要的调控作用。
Alkbh1 是Alkbh 基因家族的重要成员之一，在胚胎的早期发育中有非常重要的调控作用。运用CRISPR/Cas9 将小鼠胚胎干细胞中的Alkbh1 基因敲除后，检测结果显示N6-mA的水平会大幅度提升。这些实验结果和以前的研究结合分析，可以得出Alkbh1是N6-mA的去甲基化酶。
将小鼠胚胎干细胞中Alkbh1 敲除后，开展RNA-seq 实验。通过分析表达差异基因发现，一共有550个基因表达下调。发现这些下调表达基因发现，它们存在染色体的偏好性，绝大部分表达下调的基因都位于X 染色体上。
通过开发N6-mA DIP-seq (N6-mA DNA immunoprecipitation with anti-N6-methyladenine antibodies followed by next-generation sequencing)技术对敲除Alkbh1后胚胎干细胞进行研究，结果发现N6-mA Peak 存在于基因的间隔区，而不是存在基因的编码区，进一步分析发现绝大部分N6-mA存在于LINE上，尤其是新诞生的全长L1元件。
在敲除Alkbh1后胚胎干细胞中，可以发现X 染色体上基因（例如Gm8817 和Rhox6 ）会表达失活，但在正常的胚胎干细胞中，这些基因都是表达的。这就表明，N6-mA甲基化水平提高，不仅会导致它所调控的基因表达水平下调，甚至有可能导致基因表达沉默。
原文出处：
Wu TP, Wang T, Seetin MG et al.,2016. DNA methylation on N(6)-adenine in mammalian embryonic stem cells. Nature,532(7599): 329-333.