1.文章简介
| 文章题目 | SRSF1-Regulated Alternative Splicing in Breast Cancer |
| 中文题目 | SRSF1在乳腺癌中的选择性剪接调控 |
| 期刊名 | Molecular cell IF: 14.018 |
| 作者 | |
| 发表时间 | 2015.10 |
| 实验材料 | Organotypic three-dimensional MCF-10A cell cultures |
| 测序平台 | Genome Analyzer IIx (Illumina) |
| 相关产品 | CLIP-seq |
2.研究背景
1.可变剪接在基因表达过程中起着关键作用，最近研究表明，癌基因及肿瘤抑制因子剪接调控的紊乱与恶性肿瘤的形成关系密切。 2.SRSF1是一个典型的剪接相关蛋白，该基因被发现在人乳腺癌中呈现过度表达。同时，过表达SFSR1能够促进乳腺细胞的转化，而这一进程可能与其剪接因子的功能特性相关。 3.目前对于SRSF1对RNA的结合特性以及其调控规律还不太清楚. 4．一些研究报道表明，在果蝇和小鼠中SRSF1能够调控一系列基因的选择性剪接，但是这种剪接作用与人类疾病的相关性仍不明确。
3.研究方法
应用RNA-seq在细胞培养体系，系统的鉴定了SRSF1在乳腺癌病理形成过程中的可变剪接事件。
4.研究思路
- 鉴定SRSF1乳腺癌发生相关的剪接靶标，并且通过radioactive RT-PCR进行验证；
- 基于RNA-seq结果的SRSF1结合基序的分析；
- SRSF1在乳腺癌细胞中的调控通路研究。
5.文章亮点
- 采用3D培养形式模拟了乳腺上皮细胞疾病相关的体内生长模式；
- 全基因组范围内鉴定了乳腺癌细胞中的可变剪接事件，揭示出SRSF1新的剪接规律；
- 首次通过运用RNA-seq结果结合不同的算法和数据库，鉴定出了一个新的SRSF1结合基序；
- 首次揭示了SRSF1调控CASC4的可变剪接，参与乳腺上皮细胞的转化进程。
6.研究成果
1.RNA-seq鉴定SRSF1剪接靶标
鉴于3D模式培养的上皮细胞能够更好的模拟体内细胞的生物学特性，选取3D和2D两种培养模式，在MCF-10A细胞中过表达SRSF1，进行RNA-seq研究。同时，为了寻找MCF-10A细胞中的特异剪接事件，加入SRSF1过表达的Hela细胞作为对照。
将得到的末端配对reads 比对到human exon-trio Txdb data-base，并且通过SpliceTrap/SpliceDuo pipeline进行外显子包含的验证。与基因表达值的较大的动态范围相比，外显子包含事件的动态范围偏小，对于确定数据的统计学意义具有难度，于是利用作者发明的Splice-Duo，去捕获AS改变的分布并确认数据统计意义。
分析后的数据显示，大部分reads分布在外显子区域，其中超过半数位于蛋白质编码区域。在3D MCF-10A细胞中，检测到517个剪接事件，404个2D MCF-10A， 333个Hela细胞中（cutoff FDR<0.1）。在这些剪接事件中，第一大类是cassette exons,其次是Alternative 3’SS 和5’SS。内含子保留事件在2D培养细胞中要明显高于3D培养细胞。外显子跳跃和外显子包含事件的统计数据显示非常接近，提示SRSF1在外显子剪接激活和抑制通路中扮演着双重角色。作者应用放射性RT-PCR验证RNA-seq的结果。在所有的141个cassette exons事件中， 104个得到成功的验证。74%的数据检出率验证了seq数据的可靠性。
2.SRSF1 motif 深度分析
作者发现，RNA-seq中鉴定的44个CA-exons能够与之前报道的HEK293细胞中的CLIP-tags重叠。同时，114个CA-exons能够与MEFs细胞中的检测的CLIP-tags重叠。同时作者对这其中的18个CA-exons进行了RT-PCR检测，其中9个得到了验证。而后作者利用预测的靶标序列，在没有结合信息（如CLIP-seq）的前提下，作者重新对SRSF1的靶标结合序列进行了预测。应用psp-MEME（或者seeded psp-MEME 工具）结合RNA-seq中3D和2D细胞中SRSF1都能调控的CA-exons进行分析。该预测的motif得到了来自MCF-1OA和Hela细胞中共有的一些CA-exons的验证。令人惊讶的是，这个RNA-seq-derived的motif与之前来自SELEX和CLIP实验得到的motif非常接近（虽然这两种已报道的motif之间存在着差异）。应用核磁共振(NMR)和等温滴定法(ITC)用来进一步强有力的验证这一基序的准确性。
为了更好的理解SRSF1的调控机制，作者希望能够构建一个SRSF1的regulatory maps（调控图谱）。通过整合RNA-seq数据和鉴定到的113个SRSF1靶标，加上来自SRSF1 敲低的MEF细胞中的基因芯片数据和HEK293细胞中的CLIP数据，通过Bayesian rules构建了9个调控图谱。
作者观察到SRSF1结合至CA-exons时，靠近5’SS能够促进外显子的保留（PP>0.7），而不是跳跃（PP<0.5）。相反，SRSF1的motif发现在3’SS附近时同时能够发生外显子保留和外显子跳跃事件（两者PP>0.7）。作者通过实验对这一预测进行了验证，结果说明SRSF1能够独立行使剪接激活子功能，同时能够依赖于其它互作蛋白或者剪接因子行使剪接抑制功能。
3.SRSF1在乳腺癌中的通路调控
利用Ingenuity Pathway Analysis进行通路富集分析实验 提示3D培养的细胞中的剪接改变与乳腺癌的生物学功能相关联。同时，通路富集分析结果表明，在SRSF1过表达细胞中的相关可变剪接与基因表达调控、代谢相关基因的转录后修饰、细胞周期与细胞生长、细胞组装与形态都相关联。
作者利用MCF-10A 3D培养法对涉及癌症相关的剪接事件进行了进一步研究。将SpliceTrap/Spli-
ceDuo pipeline 应用到The Cancer Genome Atlas (TCGA)人类乳腺癌数据库，选择了57个SRSF1表达量翻倍的肿瘤和46个无SRSF1过表达的肿瘤，在至少5个肿瘤中能够重复检测到的依赖于SFSR1过表达的2181个AS剪接事件，其中大部分为外显子保留事件。其中有108个显著的AS事件在本研究中和TCGA数据中重叠。其中，三个CA-exons（CASC4，EXO1和ZNF383）和两个AA事件（MEIS2和P4HA2）在7个肿瘤中均被检测到，这些肿瘤均过表达SFSR1，而非其他的11个SR蛋白，提示这种AS事件与SRSF1高度关联。其中，CASC4剪接事件在9个肿瘤中均被检测到。SRSF1过表达促进CASC4中9号外显子（168nt）的保留，该外显子编码C端的56个特异的氨基酸，这些序列被预测具有多个磷酸化和豆蔻酰化位点。通过实验表明，SRSF1在3D培养模型中诱导产生的乳腺腺泡表型依赖于CASC4全长转录本的来实现。
原文出处：
Anczuków O et al. SRSF1-Regulated Alternative Splicing in Breast Cancer. Mol. Cell 2015, 60: 105–117.
