1.文章简介
| 文章题目 | Genomic Analysis of ADAR1 Binding and its Involvement in Multiple RNA Processing Pathways |
| 中文题目 | ADAR1基因组结合位点分析及其参与的多个RNA加工途径 |
| 期刊名 | Nat Commun IF: 11.47 |
| 作者 | |
| 发表时间 | 2015.09 |
| 实验材料 | human U87MG cells |
| 测序平台 | Illumina HiSeq 2500 sequencer |
| 相关产品 | CLIP-seq |
2.研究背景
ADAR（The proteins adenosine deaminases acting on RNA）是多细胞动物中腺苷转变为肌苷的主要调节因子。研究表明ADAR蛋白在生命的基本过程中都发挥着广泛的作用。ADAR1敲除鼠数据表明其缺失能够导致胚胎致死。ADAR2敲除之后小鼠仅能在出生后存活数天。ADAR蛋白之前被认为通过其dsRNA binding domain非特异性的结合dsRNA，然而近期研究表明，其结合靶序列还存在序列和结构的特异性，学者推测ADAR1偏向于结合至Alu重复序列，但是目前还缺乏全基因组范围的研究报道。同时研究表明，ADAR蛋白除了RNA编辑能力，可能还参与了基因表达的其它方面，例如选择性剪接、miRNA的生物合成以及冗余mRNA的降解等，但是这些结果还缺乏相关的具体机制研究。
3.研究内容
交联免疫沉淀结合高通量测序技术Cross-Linking Immunoprecipitation method followed by high-throughput sequencing (CLIP-Seq)被运用于全基因组水平揭示ADAR1靶序列的结合特点。结果表明，ADAR1在U87MG细胞中能够结合的靶序列总数为23782，其中分布在约10000个蛋白编码基因中。作者分析了靶序列的分布规律，其中大部分为Alu重复序列，第一次从全基因组水平确认了ADAR1对Alu的选择偏好性。同时，发现了15%的结合位点位于非Alu区域，进一步研究表明ADAR1结合至非Alu区域能够调控3′ UTR 的选择性使用以及pri-miRNA的生成。
4.研究思路
- 通过两个不同的抗体做CLIP-Seq实验，在全基因组范围内寻找ADAR1的结合序列；
- 分析ADAR1结合序列的序列特异性；
- ADAR1结合至非Alu区域的生物学意义研究。
5.文章亮点
本研究第一次全面地揭示了ADAR1在基因组中的结合序列的特异性分布，同时揭示了其在3′ UTR 的选择性使用的调控以及primiRNA的生成中的功能，为更好的理解该基因的功能提供了非常精彩的工作。
6.研究成果
1.ADAR1全基因组范围内的CLIP-Seq研究
通过两个ADAR1抗体构建了两个独立的clip文库。每一个文库中都包含超过10million的reads map到人类基因组数据库；同时，两个文库不同的reads结果显示大多数的CLIP标签反映出相同的pool，关于ADAR1的互作RNA。数据表明，大多数的CLIP标签与Alu原件overlap。同时，利用传统的IP-RTPCR对标签中随机挑选的序列进行了验证，结果表明CLIP-seq实验结果是可信的。
2.ADAR1结合位点分析
通过两个不同抗体构建的文库，进行后续的高通量测序，分别发现了128852个和53715个基因簇，其中32876个为二者重复的基因簇。通过对两个已经报道的RBPs(RNA binding protein)的数据分析，得到了2461个基因簇的重复，为了凸显ARAD1的特异性binding位点，对这些重叠的基因进行排除后，得到23782个基因簇，包含10321个基因。研究表明，腺苷到肌苷的转变主要集中在Alu序列中，而且分布在非编码区域。CLIP-Seq结果也表明，ADAR1主要结合至内含子的Alu区域，从全基因组层面验证了之前的假说。另外，结果表明ADAR1还有15%的靶序列分布于非-Alu区域，而且主要集中在外显子编码区和UTRs区域。在非Alu位点中，10%和8%的序列为LINE和SINE重复序列，与之前报道一小部分的A-I编辑发生在这些重复序列中相一致。而还有75%以上的非Alu序列为非重复区域。
3.ADAR1在Alu区域中的结合特点
ADAR1偏好性的结合至Alu区域，那么ADAR1的结合位点与靶序列中A-I的改变位点之间的关联性如何？作者通过分析发现，大量的reads分布在Alu正义链的右端，该区域可能通过形成RNA发卡结合被ADAR1所识别。同时，发现了ADAR1的结合位点与RNA编辑位点非常接近。
4.ADAR1竞争性结合至非Alu区域影响3‘UTR的使用
为了研究为何大量的ADAR1结合位点位于非Alu区域的3’ UTR区域，在ADAR1干扰U87MG细胞中进行了RNA-Seq去鉴定全基因组层面的3’UTR长度的差异。通过常规的3’UTR分析，提取了核心和延长的3’UTR可变形式的变化了的多聚腺苷化。其中，随机选取了四个目的序列进行验证，也支撑了seq结果。其中，ADAR1 KD细胞中3’UTR延长序列与ADAR1-CLIP位点重叠。该结果在变短的3’UTR中没有看到。说明ADAR1通过结合至3’UTR区域调控3’UTR的选择。多聚腺苷酸剪接相关因子CstF64，CstF64τ 和CF Im68 结合至3’UTR的现象出现了一定的变化，说明了ADAR1通过结合至非Alu区域，影响RNA多聚酰胺相关因子在RNA上的结合，从而影响ployA尾的长度。同时，作者发现ADAR1的RNA编辑能力与部分基因的3’UTR编辑相关（APH1B）。总的来说，ADAR1能够影响总多关键基因的多聚腺苷化，包括发育与分化、转录调控与代谢相关进程等。
5.ADAR1影响Pri-miRNAs
除了编码基因，CLIP-seq结果显示ADAR1能够分别结合至primary，precursor和mature miRNAs（分别为220，37和25个）。其中最多的为pri-miRNA序列，可能与其长度相关，或者也可能与ADAR1在细胞核中的高丰度有关联。一些已知的ADAR1-CLIP编辑靶标miRNA也出现在结果中，也支撑了我们的结果的可信度。25个miRNAS的pri-miRNA和pre-miRNA均在结果中出现，提示了我们实验数据的高度覆盖。这些结果提示，ADAR1可能通过相互作用影响primiRNA加工过程。作者在U87MG细胞中分别过表达和敲除ADAR1，对miR-21和miR-34a的表达进行了qRT-PCR验证，发现ADAR1过表达后，这两个miRNA的pri-miRNA显著下降，成熟的miRNA显著上调，而ADAR1干扰后呈现相反的趋势。相反，pri-miR-100的加工过程则在ADAR1过表达细胞中出现下调，在敲除细胞中得到增强。
为了进一步在全基因组层面验证该结论，作者在U87MG细胞中通过干扰或者过表达ADAR1，运用small-RNA sequencing进行了验证。数据分析结果显示，ADAR1能够通过与pri-miRNA结合显著增强miRNA的表达，同时，ADAR1的dsRNA结合能力与RNA编辑活性与miRNA的表达也是相关联的。作者也发现了ADAR1能够不依赖ssRNA与DROSHA和DGCR8相互作用，提示ADAR1能够通过与pri-miRNA的结合募集miRNA微处理复合体进行miRNA的剪接成熟。
原文出处：
Jae Hoon B, Jaegyoon A, Xianzhi L, et al. Genomic analysis of ADAR1 binding and its involvement in multiple RNA processing pathways. Nature Communications 6, Article number:6355.
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