IVT-seq reveals extreme bias in RNA sequencing

1.文章简介

宾夕法尼亚大学的研究者们最近使用了一项新技术来检测在RNA-seq建库和测序过程中人为引入的偏好。高通量RNA测序技术已称为基因表达和转录组分析的重要手段，但人们对不同的建库方法引入的偏好（bias）了解不足，迄今为止也没有好的手段来估算这种偏好。John B. Hogenesch的研究团队展示了通过体外转录组测序（in vitro transcription seq，IVT-seq）估算偏差的方法，可能为今后的实验设计和方法改进提供参考。

研究者们混合了1062个序列已知的人类cDNA克隆，进行体外转录，DNAse I消化，RNA纯化，rRNA消除等步骤后获得了包含1062种人类RNA的库（IVT RNA library）。对IVT RNA进行RNA-seq的结果显示，超过50%的转录本在其内部不同区域的测序丰度已表现出了极大的差异性。将IVT RNA与小鼠total RNA以1：1，1：2和1：10的比例混合后进行测序，不同样本中的同一IVT RNA转录本的测序丰度也可能出现较大差异。进一步分析显示，使用 Ribo-Zero Gold kit移除rRNA的步骤给测序结果引入了大量偏好。

此外，研究者们还评估了几种RNA序列特征对测序偏好的影响：GC含量，hexamer entropy和序列与rRNA的相似度。GC含量变化整体而言对测序偏好影响不大。Hexamer entropy是表征RNA序列复杂程度的指数，指数越低的序列测序深度和覆盖率的波动越大。这可能是因为hexamer entropy较低RNA中重复序列较多，较容易形成复杂的RNA二级结构，从而影响测序效率。而在经过rRNA消除的样本测序结果中，RNA序列与rRNA的相似度与测序偏好高度相关。相似度越高的部分，测序覆盖率和测序深度越低。

Hogenesch团队的研究者们细致分析了RNA-seq的建库操作各步骤和RNA本身序列特征对测序偏好的影响。其中最值得注意的是rRNA消除步骤对后续测序引入的大量偏好。由于现阶段的rRNA消除试剂盒的应用多是基于探针和rRNA序列之间互补碱基配对的原理，不难理解一些与rRNA序列相似度高的RNA在此步骤中也被非特异地清除了。虽然现阶段对此引入的偏好还没有有效的解决办法，但在了解这一现象后，在接下来的实验设计中需要在对照组设置，数据分析和解读等方面格外留意。

原文出处：

Lahens N F, Kavakli I H, Zhang R, et al. IVT-seq reveals extreme bias in RNA sequencing.[J]. Genome Biology, 2014, 15(6):29-42.
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