Histone H3K36 mutations promote sarcomagenesis through altered histone methylation landscape

1.文章简介

2.研究背景

根据近期研究显示，组蛋白H3基因的体细胞错义突变能够引起小儿脑和骨骼肿瘤形成。这些癌性组蛋白（命名为oncohistones），包括27位的赖氨酸突变为甲硫氨酸，34位甘氨酸突变为精氨酸或缬氨酸，以及36位赖氨酸突变为甲硫氨酸。其中，约95%的成软骨细胞瘤检出为K36M。显然，这些突变位点聚集在被人们广泛认识的组蛋白转录后修饰位点（PTMs）。为了进一步认识这些组蛋白突变致瘤的分子机制，作者在这篇文章中对H3K36M突变在成软骨细胞瘤的形成过程进行了细致研究。

3.研究方法

构建稳定过表达细胞系，用RNA-seq揭示转录组的整体差异，并且利用小鼠皮下注射的方式研究基因过表达后的成瘤效果。利用体外甲基化活性检测方法，检测突变体对甲基转移酶的活性影响。通过ChIP-seq技术，研究突变体和野生型在细胞中对整体的H3K27me3以及H3K36me3的分布差异，并且利用siRNA方法干扰对应甲基转移酶基因表达，再次利用ChIP-seq技术证实了对应甲基转移酶表达下调后，与H3K36M突变存在大量的共调控基因。在K36M过表达细胞系中，通过PRC1的亚基Ring1和Cbx2进行ChIP-seq实验，亦发现PRC1在基因区和intergenic区的分布差异。

4.研究成果

1，H3K36M突变影响成骨细胞分化

成软骨细胞瘤的细胞学特征是大量未成熟的成软骨细胞的积累。通过在小鼠间叶祖细胞（C3H10T1/2 murine MPCs）稳定表达野生型和K36M突变型蛋白（分别命名为H3.3WT和H3.3K36M ），利用RNA-seq对基因表达谱进行分析发现，H3.3WT和H3.3K36M差异表达基因聚类高度富集在细胞和发育过程，提示H3K36突变诱导涉及细胞分化功能的基因表达。增殖实验检测表明两种细胞的速率是接近的，但是H3.3K36M细胞展现出显著失调的成骨细胞分化能力。在鼠源细胞系ATDC5细胞中过表达H3K36M后也检测到显著的成骨细胞分化抑制。

2， H3.3K36M突变导致肿瘤的发生

在重症免疫缺陷（SCID）小鼠中进行皮下注射H3.3 or H3.1 K36M过表达细胞能够引发肿瘤的发生。这些肿瘤类似于人类未分化的恶性肿瘤，持续表达突变的组蛋白，并且与细胞体外基因表达谱非常接近。在十个小儿未分化软组织肿瘤中，我们发现一个肿瘤携带H3.1K36M突变。

H3.3 K36M细胞研究显示展现出显著的分化抑制特性，分化为脂肪细胞和骨细胞显著受到抑制。同时，脂肪形成和骨形成的重要调控因子表达被抑制，而维持间叶细胞多能性的转录因子表达活性被上调。
 
3，H3K36me2/3与H3K27me2/3分布的交替调控机制

在H3K36M过表达细胞中，我们发现H3K36me2/3标志显著降低，而H3K27me2/3的分布则显著上调，该现象在不同细胞中均得到验证。在我们发现H3K36M突变的小儿未分化软组织肉瘤病人个体中，我们发现还存在着H3.1K36I突变，同样，也发现H3K36低甲基化和H3K27高度甲基化现象。体外甲基转移酶活性检测表明，H3K36M/I而非H3K36R，能够抑制SETD2和NSD2的酶活性。H3K36A显著抑制NSD2的酶活，而对SETD2酶活则显示出轻度影响。免疫印迹实验检测这些蛋白表达并未受到影响，但是通过免疫沉淀实验检测得到，携带H3K36M的核小体大量结合这些甲基转移酶蛋白，提示突变组蛋白的显著隔离对抑制其活性发挥重要作用。通过对Nsd1/2和Setd2进行联合干扰（siRNA干扰实验），利用RNA-seq鉴定发现大量差异表达基因与H3.3K36M过表达细胞一致。单个干扰这些甲基转移酶编码基因能够导致H3K36me2和H3K36me3的降低。而细胞中所有H3K36甲基转移酶编码基因干扰后，H3K36me2/3修饰整体降低，而H3K27me2/3修饰整体升高。文献提示，PRC2很少对含有 H3K36me2/3的核小体进行甲基化修饰。本研究提示K36M突变介导的H3K36甲基化缺失，给PRC2提供了修饰的机会，从而导致H3K27me3水平升高。

4，H3K36M/I突变抑制其对应修饰蛋白的甲基转移酶活性

利用ChIP-seq方法，作者检测了H3K27me3和H3K36me3在细胞中的分布情况，结果显示，H3K27me3在intergenic区域大量富集，而这些区域曾被报道是大量H3K36me2甲基化修饰缺乏H3K27me3的。作者提出假说，识别H3K27me3的募集因子可能在H3.3K36M细胞中被改变，从而引起intergenic区H3K27me3修饰增强，而在基因区的H3K27me3减弱。而Ring1b和Cbx2，PRC1复合体的核心成员，负责结合H3K27me3并且介导基因表达的沉默，在H3.3K36M细胞中的靶标基因的结合显著下调。同样，在H3K36甲基转移酶表达干扰细胞系中也是如此，而H2AK119ub1在H3K27me3增多的intergenic区域则明显增多，提示PRC1在这些区域有富集。作者猜测，在H3.3K36M细胞中，PRC1在靶标基因的富集降低，使得这些基因表达活性升高，从而抑制细胞分化进程。作者发现，大量PRC1抑制基因在H3.3K36M细胞中表达得到上调，其中包括较多细胞自我更新和间叶干细胞特异表达的基因（Wnt6，Sox6）。而在MPC细胞中干扰Ring1a/b后，也能影响MPC细胞向软骨细胞的分化。转录组分析软骨细胞瘤样本结果显示大量polycome结合基因在H3.3K36M突变后表达得到上调。

5,参考文献

Lu C, Jain SU, Hoelper D, Bechet D, Molden RC, Ran L, Murphy D, Venneti S., et al.. (2006) Histone H3K36 mutations promote sarcomagenesis through altered histone methylation landscape. Science. 352(6287):844-9.