Cancer-associated SF3B1 mutations affect alternative splicing by promoting alternative branchpoint usage

1.文章简介

2研究背景

1.  组成剪接小体的多种蛋白质因子发生突变与癌症的发生发展相关联，但具体的功能机制尚不明确。
2   SF3B1 是剪接小体的核心蛋白质，在多种癌组织样本中发现该蛋白因子发生了突变。
3．SF3B1的突变与组织样本中发生的剪接异常存在相关性，但具体的调控机制还不清楚。

3研究方法

运用RNA-seq 技术并构建多个minigene进行一系列分子细胞学实验，探究SF3B1的突变对众多基因的前体mRNA 剪接的调控机制。
研究思路
1.  对大量的有SF3B1的突变肿瘤样本进行RNA-seq，分析发现SF3B1的突变影响大量基因的前体mRNA剪接 ；
2.   构建众多基因的minigene 进行分子细胞实验，探索突变的SF3B1调控大量基因剪接的机制；
3.  总结出突变的SF3B1促进识别可变分支位点的分子调控模型。
文章亮点
1．第一次揭示了SF3B1的癌症相关性突变通过促进使用可变分枝位点的方式影响可变剪接的调控机制。

4研究结果

1.SF3B1的突变促进上游可变剪接受点的识别
选取78个肿瘤组织样本，检测发现其中16个肿瘤组织中的SF3B1 发生了(p.R625 和p.K666 ) 突变。在后续实验中，选择16个SF3B1MUT  和56个SF3B1WT  样本进行RNA-seq， 对测序数据分析发现 SF3B1的突变促进上游可变剪接受点的识别 (Figure 1)。

2.剪接受体位点对SF3B1MUT  的敏感性由其周围的序列决定
构建ZNF76、DPH5、DLST等基因的minigene 进行分子细胞实验，实验结果显示异常可变剪接形式由SF3B1MUT  的位置和3′ SS 周围的序列共同调控(Figure 2)。

3. SF3B1的热点区域突变能改变自身的功能。
构建mini-gene 在HEK293T 等细胞系进行过表达、RNA干扰等分子细胞生物学实验， 试验结果显示，SF3B1MUT 既不能导致新的剪接位点产生，也不能使已有的剪接位点丢失，而是导致调控自身功能的改变(Figure 3)。

4. SF3B1MUT 促进AG’ 位点的识别不依赖U2AF
运用RNA干扰实验分别将U2AF1 和U2AF2 进行knockdown (KD)后，发现SF3B1MUT  导致的异常剪接的变化情况并不明显，说明SF3B1MUT  和U2AF 的互作很微弱(Figure 4)，SF3B1MUT 促进AG’ 位点的识别不依赖U2AF。

5. SF3B1MUT 可变分支位点的使用
通过构建mini-gene，并进行点突变，转染实验的结果显示SF3B1MUT  通过影响多分支位点的选择从而影响前体mRNA的剪接(Figure 5)。

6. SF3B1 突变导致可变剪接异常的分子调控模型.。
综合以上的实验数据，作者提出了SF3B1 在热点区域发生突变导致可变剪接异常的分子调控模型(Figure 6)。

参考文献

Alsafadi S, Houy A, Battistella A, Popova T, Wassef M, Henry E, Tirode F, Constantinou A, Piperno-Neumann S, Roman-Roman S, Dutertre M, Stern MH, 2016 .Cancer-associated SF3B1 mutations affect alternative splicing by promoting alternative branchpoint usage. Nat Commun, doi: 10.1038/ncomms10615.