RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes

1.文章简介

2.研究背景

PRC2能够通过EZH2甲基转移酶活性，修饰H3K27三甲基化抑制基因的转录表达。近些年来，表观调控研究领域的热点在于探索何种媒介介导了PRC2复合体结合至靶标染色质，从而行使表观调控的功能。其中，LncRNA介导的PRC2在染色质上的结合和基因表达调控机制已经非常清楚，例如RepA、Hotair等，但是除了LncRNA外，是否存在其它的调控因子还未解答。2012年NSMB发表文章报道Intronic RNA能够介导PRC2的顺式调控能力；2013年，同样也是NSMB发表文章表明PRC2复合体不仅能够结合LncRNA，还能与各式各样的RNA相互作用，包括成熟的mRNA；同年，NSMB文章揭示了PRC2能够结合至新生RNA，鉴于新生RNA与染色质的空间距离较近，这些线索提示新生RNA可能介导PRC2复合体对染色质的结合和调控

3.研究方法

通过GRO-seq技术，研究RBFox2敲除鼠的心肌细胞中基因表达情况，揭示该因子与基因转录的相关性，同时，结合CLIP-seq和CHIP-seq，揭示RBFox2能够基因的新生RNA以及DNA序列，结合生物信息学方法，预测到RBFox2可能的关联通路，并且进行实验验证。
研究思路和亮点
首次证明RBFox2在转录调控方面发挥功能；RBFox2与PRC2复合体多组分相互直接作用；同时，新生RNA能够介导RBFox2与PRC2复合体在染色质生的募集，调控自身的转录稳态。

4.研究成果

1.RBFox2敲除广泛影响基因的诱导表达
RBFox2敲除后的小鼠心肌细胞中，作者观察到众多成熟miRNA和pri-miRNA的表达上调，提示该剪接因子与基因转录调控有着一定的联系。通过GRO-seq，作者揭示出RBFox2敲除后，650个基因表达得到释放，247个基因转录被抑制，说明RBFox2与基因转录调控确实存在着关联。鉴于RBFox2是一个标准的RNA结合蛋白，作者同时开展了CLIP-seq和CHIP-seq，观察该蛋白与受其表达调控的基因的RNA和DNA的整体结合情况。作者发现RBFox2不仅和受其调控基因的RNA相互作用，同时，CHIP-seq信号表明，该蛋白与对应的基因组区域也有着显著分布。


2.RBFox2与染色质组蛋白修饰marker的关系
通过Bayesian network分析RBFox2的CHIP-seq数据与公共数据库中的CHIP-seq数据信号进行网络分析，得到RBFox2的结合序列与SUZ12以及H3K27me3的结合有着较高的关联性。这一分析结果进一步通过在心肌细胞中对SUZ12进行CHIP-seq分析得到验证。结果显示这两个蛋白在相同基因promoter区域都有着良好的重叠。同时，为了研究RBFox2与不同组蛋白修饰的相关性，对抑制型marker-H3K27me3和激活型marker-H3K4me3进行CHIP-seq分析，发现RBFox2和SUZ12以及H3K27me3在抑制型基因和二价基因（同时有H3K23me3和H3K4me3，报道称该类型修饰对于外界刺激特别敏感，例如发育的起始信号）启动子正负3kbp区域有着良好的共同分布，而H3K4me3则与RBFox2的CHIP-seq信号有着良好的共定位。同时，RBFox2与SUZ12的CHIP-seq结果reads有着高达50%以上的重叠，在蛋白编码基因上，重叠高达38%，提示这两个蛋白在全基因组范围内的广泛的协同调控作用。
3. RBFox2通过新生RNA介导PRC2对基因启动子区域的调控
通过siRNA在MEF细胞中对RBFox2以及SUZ12进行表达干扰，发现RBFox2干扰后，严重影响SUZ12和H3K27me3的在基因promoter区域（TSS正负3kbp区域）的CHIP信号，但是SUZ12干扰并不影响RBFox2对DNA的结合分布，说明了RBFox2对于PRC2复合体对染色质的募集是至关重要的。同时，让加入DRB抑制转录过程后，RBFox2和SUZ12的CHIP信号显著降低，说明新生RNA确实对于这两个因子在染色质上的募集的重要性。
GRO-seq数据表明，RBFox2以及SUZ12干扰后，都有着一大部分基因的表达得到释放，根据这两个蛋白与对应基因（DNA）的结合情况，作者分析数据得到这些基因表达被释放的基因与RBFox2以及SUZ12基因组结合的相关性是具统计学意义的，而因干扰而表达收到抑制的基因，则数据无显著性相关，提示其它因素或者非直接联系参与了这些基因的调控。
同时，结合GRO-seq和CHIP-seq数据，作者发现受RBFox2/suz12调控的基因主要是bivalent基因，即同时修饰有H3K27me3和H3K4me3的二价基因。
4.RBFox2与PRC2相互作用
通过正反向CO-IP实验，作者验证了RBFox2与PRC2复合体多个成员相互作用，同时得到了Pull-down结果的支持。通过RBFox2截短体的构建，原核表达和纯化，进行pull-down实验揭示了其C端氨基酸对于PRC2的结合是至关重要的。同时，在RBFox2干扰细胞系中，对RBFox2进行全长蛋白和C端截短蛋白的回补实验，作者用CHIP-PCR方法证明了全长蛋白，而非截短蛋白，能够显著增加因RBFox2干扰引起的靶基因的H3K27me3修饰降低的变化。

原文出处：

Wei C, Xiao R, Chen L, Cui H, Zhou Y, Xue Y, Hu J, Zhou B, Tsutsui T, Qiu J, Li H, Tang L, Fu XD. 2016 RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Mol Cell.,  62(6):875-89.