1.文章简介
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文章题目 |
Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP) |
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期刊名 |
Nature methods IF: 32.07 |
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发表时间 |
2016.3.28 （online） |
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单位 |
Department of Cellular and Molecular Medicine, University of California at San Diego. |
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测序平台 |
Illumina HiSeq2500 platform |
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相关产品 |
CLIP-seq |
2.研究背景
RNA结合蛋白（RNA-binding proteins, RBPs）已被认为是调节基因表达的关键因素。RNA在什么时候，什么地点以什么速率被加工，转运和细胞内的翻译控制一直是研究热点。已有的研究表明这些调节是必须的，因为RBP功能的缺失会导致很多不同的遗传和躯体的疾病，例如神经病变，自身免疫缺陷和癌症等。为了发现RBPs是如何对RNA加工产生影响的机制，大量的新技术如RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation, RIP），紫外交联免疫沉淀（crosslinking-immunoprecipitation, CLIP）等被广泛使用。当一些高通量测序（-seq）与CLIP方法结合例如, photoactivatable-ribonucleoside-enhanced CLIP (PAR-CLIP)和individual-nucleotide-resolution CLIP (iCLIP)之后RNA在体内与单核苷酸结合位点的识别将会得到很大改善。然而，当前的CLIP方法在技术上具有一定的挑战性，例如较高的失败率，CLIP-seq文库经常出现极低的complexity:在已发表的279个CLIP数据集中经过PCR重复之后有高达83.3%的CLIP-seq数据会被丢掉。此外当iCLIP由ENCODE进行大量处理时，RBPs文库产生的成功率会地很多，尤其是对那些没有被注释的RNA结合结构域。因此提高文库成功率将显著降低测序成本，极大地提高生物和技术的可重复性，并且可以使低丰度RBPs和很少靶标RNA的RBPs的RBP位点更容易识别。
3.研究方法
研究思路
本研究中作者发现传统的CLIP方法存在一些不足之处，例如可重复率低，失败率高等缺点。因此作者通过对CLIP的一些实验过程进行改进提出了新的eCLIP的方法。
文章亮点
该论文提出了一种全新的CLIP方法，称为enhanced CLIP (eCLIP)。该方法为RBPs在全基因组范围内的maps提供了一个更加强大，标准化的框架。显著的降低了测序过程中所需要扩增的次数，并且极大地提高了RBPs文库可读百分比的成功率。此外，eCLIP还改善了配对input controls的发现auehentic位点的信噪比。
4.研究成果
1.eCLIP显著改善RBPs靶标识别
eCLIP结合了iCLIP的方法对其进行了必要的修改，例如：对RNA文库制备阶段进行了改进。作者发现像iCLIP使用circular ligation的效率通常都不高。所以作者对这此进行了修改并添加了两个额外的步骤：在免疫沉淀的磁珠上添加一个3’RNA接头用于和RNA片段交联，并且添加一个3’单链（Single-stranded, SS）DNA接头用于反转录之后交联。改进之后的方法相比普通的CLIP-seq而言RBPs靶标识别率提高了2-3倍，无法读取的reads数由普通iCLIP的270个降低为60个。
eCLIP除去了一些伪影（artifacts）改进了CLIP-seq的特异性分析。作者首先分析了特异的茎环结合蛋白（Stem Loop Binding Protein, SLBP），作为区分其他能够与RNA结合的组蛋白真假的信号。实验中作者发现绝大部分基因的PRM（reads per million usable）值没有发生变化。然而，组蛋白却在3’UTR和CDS区域出现了大量的富积，相比它们的转录频率而言提高了260倍。因此eCLIP在全转录组的背景下极大的丰富了结合位点的信号。
eCLIP提高了RBP结合位点的识别需求，因此也提高了生物和技术的重复可靠性。不可重复率（Irreproducible discovery rate, IDR）分析已经是评估CLIP-seq最常用的手段。在实验中作者发现6, 751个重复的IDR值在0.01之内，低于一般iCLIP的结果。
原文出处：
Nostrand EL, Pratt GA, Shishkin AA et al. 2016. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature methods, doi: 10.1038/nmeth.3810.